꼬마 선 충 에서 도파민 신호 평가에 수영 유도 마비

Summary

수영 유도 마비 (SWIP)가 잘 설립 행동 분석 결과 꼬마 선 충 (C. 선 충)에서 신호 하는 도파민의 기본 메커니즘을 연구 하는 데 사용. 그러나, 분석 결과 수행 하는 자세한 방법을 부족 이다. 여기, 우리가 SWIP에 대 한 단계별 프로토콜을 설명합니다.

Abstract

이 프로토콜에서 설명 하는 수영 분석 결과 dopaminergic 조절 단백질을 식별 하는 유효한 도구 synapses 이다. 포유류와 마찬가지로, 도파민 (DA) C. 선 충 등 학습과 모터 활동에에서 여러 기능을 제어 합니다. 다 릴리스 (예를 들어, 암페타민 (AMPH) 치료)를 자극 하는 또는 그 다 허가 조건 (예: 동물 다 전송 부족 (dat-1) 는 뉴런을 다를 reaccumulating 할 수 있다) 세포 외 다의 과잉 생성 궁극적으로 저해 운동의 결과. 이 동작은 동물 물에서 수영 하는 때 특히 분명 하다. 사실, 야생-타입 동물 오랜된 시간 동안 수영을 계속, 하는 동안 dat 1 null 돌연변이 야생-타입 AMPH 처리 또는 억제제 다 전송의 우물의 바닥에 침 몰 하 고 이동 하지 않습니다. 이 문제는 “수영 유도 마비” (SWIP) 이라고 불린다. SWIP 분석 결과 잘 설립, 방법의 자세한 내용은 부족 한. 여기, 우리가 SWIP 수행 하는 단계별 가이드를 설명 합니다. 분석 결과 수행 하기 위해 늦은 애벌레 단계 4 동물 또는 AMPH 없이 제어 자당 솔루션을 포함 하는 유리 자리 접시에 배치 됩니다. 동물은 stereoscope에 장착 하거나 수동으로 시각화는 stereoscope 아래 자동으로 카메라와 함께 녹음 하 여 그들의 수영 동작에 대 한 득점 된다. 동영상 다음 탈 곡 주파수와 마비 열 지도 형태로 시각적 표현 생성 하는 추적 소프트웨어를 사용 하 여 분석 된다. 수동 및 자동 시스템 동물 들의 수영 능력의 쉽게 정량 판독을 보장 하 고 따라서 동물 dopaminergic 시스템 내에서 돌연변이 베어링에 대 한 또는 보조 유전자에 대 한 심사를 용이 하 게. 또한, SWIP 명료 AMPH 악용의 약물의 행동의 메커니즘을 사용할 수 있습니다.

Introduction

동물 다양 한 복잡 한 신호 처리에 의해 조정 하는 다른 신경 전달 물질에 의해 중재는 타고 난 하 고 복잡 한 동작을 수행 합니다. 신경 전달 물질 도파민 (DA) 종, 학습, 운동 기능 및 보상 처리를 포함 하 여에 걸쳐 높은 보존된 행동 중재.

토양 선 충 류 C. 선 충만 302 뉴런으로 구성 된 비교적 간단 하 고 잘 매핑된 신 경계 표시 등 짝짓기, 학습, 구하고, 운동 달걀 누워 다에 의해 규제는 많은 포함 하 여 현저 하 게 복잡 한 동작 ¹. 다른 기능, 짧은 라이프 사이클, 취급의 용이성 및 신호 분자의 보존, 중 보존된 행동의 신경 기초 공부에 대 한 모델로 C. 선 충 의 장점을 강조.

C. 선 충 자웅 동체 포함 8 dopaminergic 신경; 이들 이외에, 남자 짝짓기 목적 6 여분의 쌍을 포함 합니다. 포유류에서 이러한 신경 다 합성 하 고 다 전송 (DAT-1)는 다 다시 dopaminergic 신경 세포에 시 냅 스 갈라진 틈에 발표 전송 dopaminergic 신경에서 독점적으로 찾아낸 막 단백질을 표현 한다. 또한, 합성, 포장 및 다의 출시의 각 단계에 관련 된 단백질의 대부분은 매우 벌레와 인간 사이 보존 하 고, 같은 포유류, 다 변조 먹이 행동과 C. 선 충²운동.

C. 선 충 고체 표면에 크롤 링 하 고 물에 특성 때리는 행동으로 수영. 흥미롭게도, DAT-1 (dat-1)의 표현 부족 돌연변이 고체 표면에 일반적으로 크롤 링 하지만 물 때 수영을 유지 하기 위해 실패 합니다. 이 문제는 수영 유도 마비 또는 SWIP 되 나. 이전 실험 SWIP, 부분적으로, 발생 했다고 궁극적으로 d 2 같은 postsynaptic 수용 체 (DOP-3) overstimulates 시 냅 스 갈라진 틈에 다의 과잉에 의해 설명 했다. 원래 dat 1 녹아웃 동물³확인, SWIP 야생-타입 동물 블록 활동 DAT (예: imipramine⁴)의 약물 치료에 관찰 및 유도 다 릴리스 (예: 암페타민⁵). 다른 한편으로, 합성 및 다의 릴리스를 averting와 DOP-3 수용 체 기능을 차단 약리학 또는 유전자 조작 방지 SWIP⁶. 함께 찍은, 이러한 이미 게시 된 데이터는 설립 SWIP dopaminergic 시 냅 스^3,,47 돌연변이 단백질에 의해 발생 하는 행동 효과 공부 하 고 하에 대 한 신뢰할 수 있는 도구로 다^{7,,89,10,,1112}신호에 관련 된 소설 규제 통로의 식별에 대 한 앞으로 유전 스크린. 또한, 생체에 약물 유발 동작의 쉽게 정량 판독 함으로써 SWIP 수 암페타민 (AMPH) 같은 약물의 행동의 메커니즘의 해명 및 azaperone는 dopaminergic에서 synapses^{5, 6 , 13 , 14 , 15}.

SWIP 분석 실험을 수행 하기 위한 프로토콜¹⁶전에 설명 했습니다. 방법론 및 설치 SWIP를 효과적으로 수행 하기 위해 선 충 C. 커뮤니티에 대 한 시각적 가이드를 제공 하는 목적으로 시험을 수행 하는 여기, 우리가 자세히 설명.

Protocol

1입니다. 솔루션 및 미디어 준비 KH2포4 3.0 g (22.05 m m), 나2HPO4 6.0 g (42.2 m m), 용 해 하 여 M9 버퍼를 준비 하 고 압력가 이온 물 1 L에 NaCl 5.0 g (85.5 m m). 압력가 마로 소독 후 1m MgSO4 (12 g 100 mL 압력가 이온된 수의 최종 볼륨에서)의 1.0 mL를 추가 합니다. 결과 10 x의 믹스 100 mL 압력가 마로 소독의 900 mL와 M9 저온 1 x 솔루션. 계란 버퍼 수 있도록, HEPES 압?…

Representative Results

선물이 SWIP 분석 결과 AMPH 치료에 의해 유도 된의 예. 그림 1 에서는 위에서 설명한 대로 분석 결과 설정의 도식 대표. 수동 분석 결과, 약 8-10 나이 동기화 된 늦은 L4 단계 벌레는 속눈썹 또는 백 금 수집 선택 하 고 유리 자리 접시 200 mOsm/L 자당 (제어 솔루션) 또는 0.5 m m AMPH 자당의 40 µ L를 채워지고, SWIP에 대 한 테스트에 배치. <p class="jove_content" fo:k…

Discussion

여기, 우리는 행동 분석 결과, SWIP, C. 선 충에서 수행 하는 단계별 프로토콜을 설명 합니다. 이 프로토콜 없이 주요 기술적인 장애물이 분석 결과 매우 사용자 친화적인 만들기로 간단 하 고 직관적입니다. 그럼에도 불구 하 고, 분석 결과 효과적으로 수행 하기 위해 고려해 야 할 몇 가지 중요 한 측면 있다.

분석 결과 대 한 사용 하는 웜 때문에 식이 제한에 영향을 미치?…

Materials

Aluminum foil	Reynolds wrap	1091835
Amphetamine	Sigma	51-63-8
Autoclave
Bacterial Incubator	New Brunswick scientific	M1352-0000
Bacteriological grade, Agar	Lab Scientific, Inc	A466
Bacto (TM) Peptone	BD	REF 211677
Calcium Chloride (dihydrate)	Sigma-Aldrich	C3881
Camera	Thorlabs	U-CMAD3
Centrifuge	Eppendorf 5810R 15amp	E215059
Cholesterol	Sigma-Aldrich	57-88-5
Deionised water	Millipore	Z00QSV0WW	Milli-Q
Depression glass spot plate	Corning	Corning, Inc. 722085
Erlenmeyer flask	ThermoFisher	4103-0250PK
Eye lash
Glass slide	Fisherbrand	12-550-15
Graphing and statistical software	Prism		Graphpad 5
HEPES	Sigma-Aldrich	RB=H3375 & H7006
Hypochlorite	Hawkins	Sodium Hypochlorite 4-6%, USP" 1 gal
LB Broth, Miller	Fisher	BP1426
Magnesium Chloride (Hexahydrate)	Sigma-Aldrich	RB=M0250	500g
Magnesium sulfate (heptahydrate)	Sigma-Aldrich	M1880
Magnetic stir bar	Fisherbrand	16-800-510
Microcentrifuge tubes	ThermoFisher	69715
NA 22 bacteria	CGC
Nystatin	Sigma	1400-61-9
Osmometer	Advanced Instruments, Inc	Model 3320
Pasteur Pipettes	Fisherbrand	13-678-20A
Petriplates	Falcon	351007
pH Meter	Orion VersaStar Pro	IS-68X591202-B 0514
Polystrine conical tubes	Falcon	352095
Potassium Chloride	Sigma-Aldrich	P9541
Potassium dihydrogen phosphate	Sigma-Aldrich	7778-77-0
Potassium Phosphate – DIBASIC	Sigma-Aldrich	P-8281
Potassium Phosphate – MONOBASIC	Sigma-Aldrich	P0662
Serological pipettes	VWR	10ml=89130-898
Shaker	Reliable Scientific	55S 12×16
Sodium Chloride	Fisher	RB=BP358-1
Sodium dihydrogen Phosphate	Fisher	RB=S381
Spreadsheet	MS office		Microsoft Excel
Stereo Microscope	Zeiss	Model tlb3. 1 stemi2000
Sterile Pipette tips	Various	02-707-400
Sucrose	Sigma-Aldrich	RB=S5016
Superglue	Loctite	1647358 .14 oz.
SwimR sofware	10.18129/B9.bioc.SwimR
Tracker 2	Worm Tracker 2.0	www.mrc-lmb.cam.ac.uk/wormtracker/
Video recording software	Virtualdub	http://www.virtualdub.org/