Qui, presentiamo protocolli per studiare danno dell'unità neurovascolare durante l'encefalomielite autoimmune sperimentale in vivo. Ci rivolgiamo in particolare come determinare la permeabilità della barriera emato - encefalica e attività della gelatinasi coinvolti nella migrazione dei leucociti attraverso la limitans glia.
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Articolo metodologico
Visualizzazione di danno delle barriere endoteliali e gliali dell'unità neurovascolare durante l'encefalomielite Autoimmune Sperimentale In Vivo
In questo articolo
Sommario
Abstract
L'unità neurovascolare (NVU) è composto da cellule endoteliali microvascolari formando l'emato - encefalica (BBB), una membrana basale endoteliale con periciti incorporati, e la limitans glia composto da membrana dello scantinato parenchimatica e astrocitari alimentazione di testata che abbracciano l'aspetto abluminale di microvasi del sistema nervoso centrale (SNC). Oltre a mantenere CNS omeostasi il NVU controlla delle cellule immuni traffico nello SNC. Durante immunosorveglianza dello SNC basso numero di linfociti attivati può attraversare la barriera endoteliale senza causare BBB disfunzione o malattia clinica. Al contrario, durante la neuroinfiammazione come nella sclerosi multipla o il modello animale encefalomielite autoimmune sperimentale (EAE) un gran numero di cellule del sistema immunitario può attraversare la BBB e, successivamente, la glia limitans raggiungendo alla fine il parenchima di CNS che conducono alla malattia clinica. Migrazione delle cellule immuni nel parenchima CNS è dunque un processo in due fasi che comporta una migrazione sequenza attraverso la barriera endoteliale e gliale di NVU che impiegano meccanismi molecolari distinti. Se dopo il loro passaggio attraverso la barriera endoteliale, cellule T incontrano loro antigene cognate su cellule presentanti l'antigene perivascolare loro riattivazione locale avvierà successivi meccanismi che portano all'attivazione focale della gelatinasi, che consentirà le cellule di T di attraversare la barriera glial e immettere il parenchima di CNS. Così, valutazione, permeabilità BBB e attività MMP in correlazione spaziale per accumulo di cellule immuni nel SNC durante EAE permette di specificare perdita di integrità delle barriere endoteliali e gliali la nvu. Mostriamo qui come indurre EAE in topi C57BL/6 di immunizzazione attiva e come analizzare successivamente permeabilità BBB in vivo usando una combinazione di traccianti fluorescenti esogeni. Più ulteriormente indichiamo, come visualizzare e localizzare attività della gelatinasi nei cervelli EAE in situ zymogaphy accoppiato al immunofluorescente stainings di membrane dello scantinato BBB e CD45 + cellule immunitarie invasori.
Introduzione
Il sistema nervoso centrale (SNC) coordina tutto il corpo e funzioni mentali nei vertebrati, e l'omeostasi del CNS è essenziale per una corretta comunicazione dei neuroni. Omeostasi del CNS è garantito dall'unità neurovascolare (NVU), che protegge il sistema nervoso centrale da milieu cambiamento del flusso sanguigno. Il NVU è composto di cellule endoteliali microvascolari CNS, che sono biochimicamente unici e stabilire l'emato - encefalica (BBB) continuo crosstalk con periciti, astrociti, neuroni e componenti della matrice extracellulare (ECM), che istituisce due distinta delle membrane dello scantinato1. La membrana basale endoteliale che ens....
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Protocollo
Tutti gli studi sono stati condotti sotto la Guida di riferimento secondo la legislazione svizzera sulla protezione degli animali e sono stati approvati dall'ufficio veterinario del Cantone di Berna, in Svizzera (numeri di autorizzazione: BE 31/17 ed essere 77/18).
1. alloggiamento dei topi C57BL/6 in condizioni di agente patogeno specifico gratuite (SPF)
- Ciclo di casa topi in gabbie individuali ventilate con un 12/12 h chiaro-scuro. Fornire cibo e acqua ad libidum. Per sorvegliare la qualità microbiologica dei topi, il gruppo sperimentale ha subito monitoraggio trimestrale da sentinelle di biancheria sporca segue il FELASA consig....
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Risultati
Valutazione del decorso clinico di EAE in topi C57BL/6 dovrebbe risultare in una curva di malattia come raffigurato in Figura 2A e cambiamenti nel peso corporeo del mouse come presentato nella Figura 2B. C57BL/6 topi immunizzati con MOGaa35-55 solitamente iniziano a sviluppare i sintomi della malattia circa 10-12 giorno dopo immunizzazione attiva (Figura 1A). In genere, topi immunizzati mostrano un calo transitorio del peso corporeo.......
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Discussione
Qui, presentiamo un protocollo per indurre e monitorare EAE in topi femminili C57BL/6. Le femmine sono preferenzialmente scelti, e c'è un'incidenza delle donne: gli uomini di 3:1 in MS. Per valutare la severità di EAE, abbiamo fatto uso di un foglio di Punteggio 3 punti. Gravità EAE è generalmente segnato per quanto riguarda la gravità delle disfunzioni motore. Topi con fasi avanzate di EAE, vale a dire che esibiscono un punteggio superiore a 2 dovrebbe essere sacrificata per evitare inutili sofferenze degli animali. Per.......
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Dichiarazioni
Conflitti di interesse non dichiarati.
Ringraziamenti
Noi riconosciamo con gratitudine Lydia Sorokin, che ha condiviso il suo originale in situ zymography protocollo10 con noi.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| AMCA anticorpo anti-coniglio | Jackson ImmunoResearch | 111-156-045 | Negozio a 4 ° C; proteggere dalla luce |
| Anticorpo anti-CD45 (30F11) | Pharmingen | 07-1401 | Conservare a 4 ° C |
| Anticorpo anti-laminina | DAKO | Z0097 | Negozio a 4 gradi C |
| Mangime per l'allevamento | ad es. PROVIMI KLIBA SA | 3336 | |
| Gabbie ventilate individualmente, linea blu Tipo II o III, | ad es. Tecniplast | 1145T, 1285L | |
| BSA frazione V | Applichem | A1391 | Conservare a 4 gradi; C |
| Gelatina fredda | Sigma-Aldrich | G 9391 | |
| Barattolo Coplin + rastrelliera | , ad es. Carl Roth GmbH + Co. KG | H554.1; H552.1 | |
| Cy3 anticorpo anti-ratto | Jackson ImmunoResearch | 111-156-144 | Conservare a 4 gradi; C; proteggere dalla luce |
| Vetrini coprioggetti 24 x 40 mm # 1 | ad es. Thermo Scientific | 85-0186-00 | |
| Destrano Alexa Fluor 488 (10.000 MW) | ad es. Sonde molecolari | D22910 | Conservare a -20 ° C; proteggere dalla luce |
| Destrano Texas Red (3000 MW) | Invitrogen | D3328 | Conservare a -20 ° C; proteggere dalla luce |
| Kit per il dosaggio della gelatinasi/collagenasi EnzChek | Thermo Fisher Scientifico; EnzCheck | E12055 | Negozio a -20 C; proteggere dalla luce |
| Topi femmina C57BL/6J (8-12 settimane) | ad es. Janvier Labs | Femmine, 8-12 settimane | |
| Scatola di congelamento per vetrini istologici | , ad es. Carl Roth GmbH + Co. KG | 2285.1 | |
| 18G x 1½ ’ ’ ago per iniezione (1,2 mm x 40 mm), | ad es. BD, BD Microlance 3 | 304622 | |
| 27G x ¾ ’ ’ – Nr. 20 (0,4mm x 19mm) ago per iniezione | es. BD, BD Microlance 3 | 302200 | |
| 30G x ½ ’ ’ ago per iniezione (0,3 mm x 13 mm), | ad es. BD, BD Microlance 3 | 304000 | |
| Freund' incompleto s adiuvante (IFA) | es. Santa Cruz Biotechnology | sc-24648 | Negozio a 4° C |
| Alimenti di manutenzione | , ad es. PROVIMI KLIBA SA | 3436 | |
| MOGaa35-55 peptide | , ad es. GenScript | Store a -80 ° C | |
| vetrini per microscopio (Superfrost Plus ) | Thermo Scientific | J1800AMNZ | |
| Mycobacterium tuberculosis H37RA | es. BD | 231141 | Conservare a 4 gradi; C |
| NaCl 0,9 % | B. Braun | 3535789 | |
| composto O.C.T. (Tissue-Tek ) | Sakura | 4583 | |
| Omnican 50 30G x ½ ’ » | B. Braun | 9151125S | |
| Paraformaldeide | Merck | 30525-89-4 | |
| Tossina della pertosse | , ad es. Elenco laboratori biologici, Inc. | 180 | Negozio a 4 gradi C |
| poli(alcol vinilico) (Mowiol 4-88) | Sigma-Aldrich | 81381 | |
| Inibitore della proteasi EDTA senza EDTA (Roche) | Sigma-Aldrich 4693132001 | Negozio a 4 gradi; C | |
| penna repellente, ad es. DAKO Pen | ad es. DAKO | S2002 | |
| pellicola sigillante, ad es. Parafilm M | , ad es. Sigma-Aldrich | P7793 | |
| gel di silice | ad es. Carl Roth GmbH + Co. KG | 9351.1 | |
| Forbice per cuciture | F.S.T | 15012-12 | |
| siringa, 1 ml | , ad es. PRIMO | 62.1002 | |
| siringa da 10 ml | , ad es. CODAN Medical Sistema | 2022-05 | |
| Univentor 400 | UNO. Bv |
Riferimenti
- Tietz, S., Engelhardt, B. Brain barriers: Crosstalk between complex tight junctions and adherens junctions. Journal of Cell Biology. 209, 493-506 (2015).
- Wu, C., et al. Endothelial basement membrane lamini....
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