Per osservare l'ultrastruttura della sensilla degli insetti, nello studio è stata presentata la microscopia elettronica di scansione e trasmissione (rispettivamente SEM e TEM). Tween 20 è stato aggiunto nel fissativo per evitare la deformazione del campione nella microscopia seM.
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Articolo metodologico
Esempio di metodo di preparazione del microscopio elettronico di scansione e trasmissione per le appendici di Woodboring Beetle
In questo articolo
Sommario
Abstract
Questo rapporto ha descritto i metodi di preparazione dei campioni che la scansione e le osservazioni al microscopio elettronico a trasmissione, dimostrati preparando le appendici del coleottero legnoso, Chlorophorus caragana Xie & Wang (2012), per entrambi i tipi di microscopia elettronica. Il protocollo di preparazione del campione di microscopia elettronica a scansione (SEM) si è basato sulla fissazione chimica del campione, sulla disidratazione in una serie di bagni di etanolo, sull'essiccazione e sul rivestimento sputter. Aggiungendo Tween 20 (Polyoxyethylene sorbitan laurate) al fissativo e alla soluzione di lavaggio, la superficie del corpo dell'insetto dello scarabeo legnoso è stata lavata in modo più pulito in SEM. La preparazione del campione di microscopia elettronica a trasmissione (TEM) di questo studio ha comportato una serie di passaggi, tra cui fissazione, disidratazione dell'etanolo, incorporamento in resina, posizionamento mediante microscopia a fluorescenza, sezionamento e colorazione. Fissativo con Tween 20 ha permesso di penetrare la parete del corpo degli insetti di coleottero legnoso più facilmente di quanto lo sarebbe stato senza Tween 20, e successivamente tessuti e organi fissi migliori nel corpo, ha quindi prodotto osservazioni chiare al microscopio elettronico delle ultrastrutture della sensilla degli insetti. Il passo successivo di questa preparazione è stato determinare le posizioni della sensilla degli insetti nel campione incorporato nel blocco di resina utilizzando la microscopia a fluorescenza per aumentare la precisione del posizionamento della sensilla bersaglio. Questo ha migliorato la precisione di taglio.
Introduzione
La microscopia elettronica a scansione è uno strumento importante in molti studi di morfologia, che SEM mostra le strutture superficiali1,2. L'appeal della microscopia elettronica a trasmissione è che può essere utilizzata per studiare un'ampia gamma di strutture biologiche su scala nanometrica, dall'architettura delle cellule e l'ultrastruttura degli organelli, alla struttura dei complessi macromolecolari e delle proteine. TEM mostra le strutture interne3,4,5.
Coleoptera è il più grande gr....
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Protocollo
INFORMATIVA: Consultare le schede tecniche di sicurezza dei materiali dei reagenti prima di utilizzarle. Molte delle sostanze chimiche utilizzate durante la preparazione del campione sono tossiche, mutageni, cancerogene e/o reprotossiche. Usa dispositivi di protezione personali (guanti, camice da laboratorio, pantaloni a figura intera e scarpe chiuse) e lavora sotto un cofano a fumi mentre maneggia il campione.
1. Preparazione e imaging dei campioni SEM
- Correzione e pulizia dei campioni
- Lavorando in una zona in cui si verifica C. caragana, attirare gli adulti in trappole da campo esche con attrattivi vegetali, com....
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Risultati
Utilizzando la soluzione di pulizia e fissativa con Tween 20, è stata osservata un'immagine SEM più pulita di quella senza Tween 20 (Figura 3). Tween 20 soluzione di fissaggio penetrato la soluzione di fissaggio glutaraldeide nel tessuto. La struttura dei microtubuli è stata chiaramente osservata. L'immagine TEM della struttura interna del campione è stata sfocata senza Tween 20 (Figura 4).
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Discussione
In questo articolo, abbiamo presentato uno schema di preparazione dei campioni per la microscopia elettronica di scansione e trasmissione per coleottero che falegname. Utilizzando l'appendice degli insetti come soggetto di studio rappresentativo, abbiamo dimostrato diversi miglioramenti rispetto ai metodi tradizionali di preparazione dei campioni.
L'olio liquido staccato dalla superficie solida viene emulsionato in piccole goccioline, che possono essere ben disperse e sospese nel mezzo di lava.......
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Dichiarazioni
Non abbiamo alcun conflitto di interessi da rivelare.
Ringraziamenti
Apprezziamo la generosa assistenza del Beijing Vocational College of Agriculture, dell'Institute for the Application of Atomic Energy (Accademia cinese delle scienze agricole), del Centro di bioricerca dell'Università forestale di Pechino e del professor Shan-gan dell'Istituto di zoologia dell'Accademia Cinese delle Scienze. Questa ricerca è stata sostenuta dal National Key R&D Program of China (2017YFD0600103), dalla National Natural Science Foundation of China (Grant n. 31570643, 81774015), dalla ricerca scientifica forestale nel Welfare pubblico della Cina (201504304), dalla Mongolia Interna della Mongolia Piano di avvio della ricerca sui talenti dell'Università de....
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Lente anatomica | Chongqing Auto Optical società a responsabilità limitata | 1425277 | |
| Nastro adesivo in carbonio | SPI Supplies, Division of Structure Probes, Inc. | 7311 | |
| Tetracloruro di carbonio | Sigma | 56-23-5 | |
| Griglie in rame | GilderGrids | G300 | |
| Idrogeno fosfato disodico | Sinopharm group chemical reagent co., LTD | 10039-32-4 | |
| Etanolo | J.T. Baker | 64-17-5 | |
| Stampi per inclusione piatti | Hyde Venture (Beijing) Biotechnology Co., Ltd. | 70900 | |
| Microscopio a fluorescenza | LEICA | DM2500 | |
| Glutaraldeide | Sigma-Aldrich | 111-30-8 | Anidro |
| Isoforone | Sigma | 78-59-1 | |
| Citrato di piombo | Sigma | 512-26-5 | |
| Metanolo | Sigma | 67-56-1 | |
| Fosfato di sodio monobasico | Its gruppo reagente chimico co., LTD | 7558-80-7 | |
| Micrometro obiettivo | Olympus | 0-001-034 | |
| Tetrossido di osmio | Sigma | 541-09-3 | |
| Piastra di Petri | Aldrich | 1998 | |
| Lama di rasoio | Gillette | ||
| Resina | Spurr | ERL4221 | |
| Bisturi | Lianhui | GB/ T19001-2008 | |
| SEM | Hitachi | S-3400 | |
| gel di silice essiccante | Suzhou Longhui essiccante Co., Ltd. | 112926-00-8 | |
| Spazzola piccola | Martol | G1220 | |
| Idrossido di sodio | Sigma | 1310-73-2 | |
| Strumento ionico Sputter | Hitachi Koki Co. Ltd., Tokyo, Giappone | E-1010 | |
| Stereomicroscopio | Leica | EZ4 HD | |
| TEM | Hitachi | H-7500 | |
| Tween 20 | Tianjin Damao Reagente chimico | 9005-64-5 | |
| Ultramicrotomo | Leica | UC6 | |
| Pulitore ad ultrasuoni | GT Sonic | GT-X1 | |
| Acetato di uranile | Sigma | 6159-44-0 |
Riferimenti
- Song, Y. Q., Dong, J. F., Sun, H. Z. Scanning Electron Microscope Technology of Insect Material. Hubei Agricultural Sciences. 52, 1064-1065 (2013).
- Liu, C. The develo....
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Ristampe e permessi
