Para observar a ultraestrutura da sensilla de insetos, foi apresentado o protocolo de preparação de amostras de varredura e transmissão (SEM e TEM), respectivamente) no estudo. O Tween 20 foi adicionado ao fixativo para evitar a deformação amostral na microscopia de fluorescência SEM. Foi útil para melhorar a precisão do corte na TEM.
Este relatório descreveu métodos de preparação de amostras que escaneiam e transmissam observações de microscópio eletrônico, demonstrados preparando apêndices do besouro lenhador, Chlorophorus caragana Xie & Wang (2012), para ambos os tipos de microscopia eletrônica. O protocolo de preparação de amostras de microscopia eletrônica de varredura (SEM) foi baseado na fixação química da amostra, desidratação em uma série de banhos de etanol, secagem e revestimento de sputter. Adicionando Tween 20 (Polioxyetileno sorbitan laurate) à solução fixa e de lavagem, a superfície do corpo de insetos de besouro lenhador foi lavada de forma mais limpa em SEM. A preparação de amostras de microscopia eletrônica de transmissão deste estudo (TEM) envolveu uma série de etapas, incluindo fixação, desidratação do etanol, incorporação de resina, posicionamento utilizando microscopia de fluorescência, secção e coloração. Fixante com Interpolado 20 habilitado penetrar a parede corporal do inseto de besouro lenhado mais facilmente do que teria sido sem Tween 20, e posteriormente melhores tecidos fixos e órgãos no corpo, resultando assim em observações claras de microscópio eletrônico de transmissão de ultraestruturas de insetos sensilla. O próximo passo desta preparação foi determinar as posições de sensilla de insetos na amostra embutida no bloco de resina usando microscopia de fluorescência para aumentar a precisão do posicionamento da sensilla alvo. Isso melhorou a precisão do corte.
A microscopia eletrônica de digitalização é uma ferramenta importante em muitos estudos de morfologia, que o SEM mostra estruturas superficiais1,2. O apelo da microscopia eletrônica de transmissão é que ele possa ser usado para estudar uma ampla gama de estruturas biológicas na escala de nanômetros, desde a arquitetura das células e a ultraestrutura das organelas, até a estrutura de complexos e proteínas macromoleculares. Tem mostra estruturas internas3,4,5.
Coleoptera é o maior grupo de insetos, incluindo cerca de 182 famílias e 350.000 espécies. A maioria dos insetos coleopteranos, em particular besouro samadeirado, se alimentam de plantas, muitas das quais são pragas importantes de florestas e árvores frutíferas, causando danos devastadores às árvores6. Atualmente, a prevenção e controle da população de pragas baseadas na teoria da ecologia química têm recebido cada vez mais atenção7. Métodos eficientes, baixotóxicos e livres de feromôona tornaram-se uma maneira eficaz8. Estudar a morfologia sensilla e a ultraestrutura dos insetos é uma parte importante da pesquisa de ecologia química de insetos. A microscopia eletrônica de digitalização e transmissão (SEM e TEM, respectivamente) é usada para grande efeito para estudar sua morfologia e anatomia interna. No entanto, durante a preparação de amostras de insetos para microscopia eletrônica (EM), a objetividade e autenticidade do local de observação podem ser afetadas9. Em geral, a preparação de amostras sem de insetos requer limpeza, fixação tecidual, desidratação, metatese, secagem e revestimento de sputter10. Devido ao ambiente complexo em que vive o besouro lenhador, a superfície corporal muitas vezes tem vários poluentes e seus apêndices muitas vezes têm muitas sensilla ou cerdas longas finas. Em particular, alguns lenhadores não estão disponíveis a partir da captação laboratorial, que coletou diretamente no campo, e depois colocado em fluido de fixação para garantir o frescor e, posteriormente, lavado em laboratório. Se a amostra for primeiro fixae e depois lavada, obviamente é muito mais difícil remover detritos porque glutaraldehyde a fixa fortemente na amostra. O Tween 20 é um surfactante11,12,13,14, que desempenha um papel importante no processo de lavagem, incluindo a redução da tensão superficial da água e a melhoria da umidade da água na superfície da lavanderia. Neste estudo, tween 20 foi adicionado à solução de fixação e solução de limpeza PBS para reduzir a tensão superficial do líquido, e impedir que a sujeira depositasse na superfície corporal do besouro lenhador, o que fez a superfície do corpo mais limpa no SEM.
Usando tem, sensilla em diferentes órgãos de insetos pode ser fatiado para revelar as estruturas claras dentro deles, fornecendo assim uma base para analisar funções sensilla. Quando o inseto sujeito, como o besouro lenhador, é grande, e sua parede corporal tem um grau substancial de esclerotização, de modo que o fixativo pode não saturar totalmente os tecidos dos órgãos dentro do corpo do inseto. O Tween 20 pode aumentar a capacidade de dispersão e suspensão da sujeira. Neste estudo, Tween 20 foi adicionado ao fixativo para aumentar a penetração fixa do fluido na parede corporal do inseto de besouro lenhador, evitando a deformação e o colapso da epidermi11,12,13. Além disso, usando tecnologia geral de fatiamento, é difícil localizar com precisão diferentes tipos de sensilla, em particular para alguma pequena sensilla15. Com base na preparação tradicional da amostra TEM, este estudo combinou microscopia de fluorescência e SEM para determinar a posição de sensilla de insetos no bloco embarcado, melhorando assim a precisão do corte.
Neste artigo, apresentamos um esquema de preparação de amostras para digitalização e microscopia eletrônica de transmissão para besouro lenhador. Usando o apêndice de insetos como um sujeito representativo do estudo, demonstramos várias melhorias em relação aos métodos tradicionais de preparação de amostras.
O óleo líquido desconectado da superfície sólida é emulsificado em pequenas gotículas, que podem ser bem dispersas e suspensas no meio de lavagem para reduzir o redepós…
The authors have nothing to disclose.
Agradecemos a generosa assistência do Beijing Vocational College of Agriculture, do Instituto para a Aplicação da Energia Atômica (Academia Chinesa de Ciência agrícola), do Centro de Biopesquisa da Universidade Florestal de Pequim e do Professor Shan-gan. Zhang do Instituto de Zoologia da Academia Chinesa de Ciências. Esta pesquisa foi apoiada pelo Programa Nacional de P&D da China (2017YFD0600103), da Fundação Nacional de Ciência Natural da China (Grant nº 31570643, 81774015), Pesquisa Científica Florestal no Bem-Estar Público da China (201504304), Mongólia Interior Plano de Startups de Pesquisa de Talentos de alto nível da Universidade Agrícola (203206038) e projeto de pesquisa de ensino superior da Região Autônoma da Mongólia Interior (NJZZ18047), Região Autônoma da Mongólia Interior Linxue “Dupla primeira classe” Projeto de Construção (170001).
Anatomical lens | Chongqing Auto Optical limited liability company |
1425277 | |
Carbon adhesive tape | SPI Supplies, Division of Structure Probes, Inc. | 7311 | |
Carbon tetrachloride | Sigma | 56-23-5 | |
Copper grids | GilderGrids | G300 | |
Disodium hydrogen phosphate | Sinopharm group chemical reagent co., LTD | 10039-32-4 | |
Ethanol | J.T. Baker | 64-17-5 | |
Flat embedding molds | Hyde Venture (Beijing) Biotechnology Co., Ltd. | 70900 | |
Fluorescence microscope | LEICA | DM2500 | |
Glutaraldehyde | Sigma-Aldrich | 111-30-8 | Anhydrous EM Grade |
Isophorone | Sigma | 78-59-1 | |
Lead citrate | Sigma | 512-26-5 | |
Methanol | Sigma | 67-56-1 | |
Monobasic sodium phosphate | Its group chemical reagent co., LTD | 7558-80-7 | |
Objective micrometer | Olympus | 0-001-034 | |
Osmium tetroxide | Sigma | 541-09-3 | |
Petri dish | Aldrich | 1998 | |
Razor blade | Gillette | ||
Resin | Spurr | ERL4221 | |
Scalpel | Lianhui | GB/T19001-2008 | |
SEM | Hitachi | S-3400 | |
Silica gel desiccant | Suzhou Longhui Desiccant Co., Ltd. | 112926-00-8 | |
Small brush | Martol | G1220 | |
Sodium hydroxide | Sigma | 1310-73-2 | |
Sputter ion instrument | Hitachi Koki Co. Ltd., Tokyo, Japan | E-1010 | |
Stereo microscope | Leica | EZ4 HD | |
TEM | Hitachi | H-7500 | |
Tween 20 | Tianjin Damao Chemical Reagent | 9005-64-5 | |
Ultramicrotome | Leica | UC6 | |
Ultrasonic cleaner | GT Sonic | GT-X1 | |
Uranyl acetate | Sigma | 6159-44-0 |