التعريفي وتوصيف ارتفاع ضغط الدم الرئوي في الفئران باستخدام نموذج نقص الأكسجة/SU5416
Summary
يصف هذا البروتوكول تحريض ارتفاع ضغط الدم الرئوي (PH) في الفئران على أساس التعرض لنقص الأكسجة وحقن خصم مستقبلات VEGF. الحيوانات تطوير PH والبطين الأيمن (RV) تضخم بعد 3 أسابيع من بدء البروتوكول. كما يتم عرض توصيف النموذج الوظيفي والماورومتري.
Abstract
ارتفاع ضغط الدم الرئوي (PH) هو حالة فيزيائية مرضية، يحددها متوسط ضغط الشريان الرئوي الذي يتجاوز 25 مم زئبق في بقية، كما يتم تقييمه بواسطة قسطرة القلب الأيمن. يمكن أن تؤدي مجموعة واسعة من الأمراض إلى PH ، تختلف في مسبباتها ، علم الأنسجة ، العرض السريري ، التكهن ، والاستجابة للعلاج. على الرغم من التقدم الكبير الذي تحقق في السنوات الأخيرة، لا تزال PH مرضًا غير مشذب. يمكن أن يمهد فهم الآليات الأساسية الطريق لتطوير علاجات جديدة. النماذج الحيوانية هي أدوات بحثية مهمة لتحقيق هذا الهدف. وفي الوقت الراهن، هناك عدة نماذج متاحة لتلخيص PH. يصف هذا البروتوكول طراز PH ماوس اثنين. المحفزات لتطوير PH هي نقص الأكسجة وحقن SU5416، عامل نمو بطانة الأوعية الدموية (VEGF) مستقبلات الخصم. بعد ثلاثة أسابيع من بدء نقص الأكسجة/SU5416، والحيوانات تطوير إعادة عرض الأوعية الدموية الرئوية تقليد التغيرات الهسجية لوحظ في PH الإنسان (في الغالب المجموعة 1). يؤدي إعادة عرض الأوعية الدموية في الدورة الدموية الرئوية إلى إعادة عرض البطين الأيمن (RV). يتم وصف إجراءات قياس ضغط RV (باستخدام طريقة الصدر المفتوح) والتحليلات المورفوميترية للRV (عن طريق تشريح وزن كل من البطينين القلبي) والتقييمات النسيجية لإعادة عرض (سواء الرئية عن طريق تقييم إعادة عرض الأوعية الدموية والقلب عن طريق تقييم تضخم القلب والتليف RV). مزايا هذا البروتوكول هي إمكانية تطبيق سواء في نوع البرية وفي الفئران المعدلة وراثيا، وتنفيذ سهل نسبيا ومنخفض التكلفة، والتطور السريع لمرض الفائدة (3 أسابيع). القيود من هذه الطريقة هي أن الفئران لا تتطور النمط الظاهري الشديد وPH هو عكس عند العودة إلى normoxia. الوقاية، فضلا عن دراسات العلاج، يمكن بسهولة أن تنفذ في هذا النموذج، دون الحاجة إلى المهارات المتقدمة (بدلا من نماذج القوارض الجراحية).
Introduction
ارتفاع ضغط الدم الرئوي (PH) هو حالة فيزيائية مرضية، يتم تعريفها بواسطة ضغط متوسط الشريان الرئوي (PA) يتجاوز 25 مم زئبق في بقية، كما تم تقييمها بواسطة القسطرة القلب الأيمن1،2. هناك مجموعة متنوعة من الأمراض التي يمكن أن تؤدي إلى PH. وفي محاولة لتنظيم الظروف المرتبطة بال PH، تم وضع عدة نظم تصنيف. التصنيف السريري الحالي يصنف الأمراض المتعددة المرتبطة PH في 5 مجموعات مختلفة1. هذا التمييز له أهمية منذ مجموعات مختلفة من المرضى لديهم الأمراض التي تختلف في العرض السريري، وعلم الأمراض، والتكهن، والاستجابة للعلاج2. يلخص الجدول 1 التصنيف الحالي، المكمّل بالخصائص الهستوولوجية الأساسية لكل مرض.
الجدول 1: نظرة عامة على التصنيف السريري لـ PH، إلى جانب السمات الهستوولوجية الرئيسية داخل المجموعات. ملاءمة بروتوكول نقص الأكسجة/SU5416 لنم تصميم PH. تم تعديل هذا الجدول من19. PH: ارتفاع ضغط الدم الرئوي، PAH: ارتفاع ضغط الدم الشرياني الرئوي
على الرغم من التقدم الكبير في علاج الأمراض المرتبطة بال PH ، لا يزال PH بدون علاج ، مع معدل وفيات لمدة 3 سنوات يتراوح بين 20 ٪ و 80 ٪3. وهذا يدل على الحاجة الملحة لفهم الآليات الأساسية للPH، وبعد ذلك، تطوير علاجات جديدة لمنع، وإبطاء التقدم، وعلاج المرض. النماذج الحيوانية ذات أهمية حاسمة لهذا النطاق. حاليا، هناك نماذج مختلفة لدراسة PH. ويحال القارئ المهتم إلى الاستعراضات الممتازة حول هذا الموضوع2,3,4. مع الأخذ في الاعتبار مجموعة متنوعة من الأمراض المؤدية إلى PH، فمن الواضح أن الظروف المتنوعة من PH الإنسان لا يمكن أن تكون ملخصة تماما في نموذج واحد. نماذج الحيوانات المتاحة يمكن تصنيفها في ط) ضرب واحد، ثانيا) ضربتين، iii) خروج المغلوب، و4) نماذج overexpression3. في نماذج ضرب واحد، يتم حث PH من قبل حافز واحد المرضية، في حين أن اثنين من ضرب نماذج الجمع بين اثنين من المحفزات المرضية مع هدف تحفيز PH أكثر شدة، وبالتالي تقليد أكثر عن كثب مرض الإنسان المعقدة. وإلى جانب الاختلافات المسببة، والنتيجة العديد من المحفزات في الاختلافات النمذجة PH التي تعتمد أيضا على الأنواع والخلفية الوراثية للحيوانات4.
واحدة من النماذج الأكثر شيوعا والقواة الكلاسيكية PH هو نموذج نقص الأكسجة المزمن2. ومن المعروف نقص الأكسجة للحث PH في البشر وكذلك في العديد من أنواع الحيوانات. نقص الأكسجة لديه ميزة كونه حافزا فيزيولوجيا لPH(الجدول 1). ومع ذلك ، في حين أن درجة نقص الأكسجة المستخدمة في تحفيز PH في القوارض هي أكثر حدة مما هي عليه في البشر ، فإن الإهانة الوحيدة (نقص الأكسجة) تؤدي فقط إلى شكل خفيف من إعادة عرض الأوعية الدموية. هذا لا يقلد شدة المرض البشري. إضافة ضرب الثانية، وحافز إضافي لتحفيز PH، وأظهرت نتائج واعدة: حقن SU5416 المركب للقوارض جنبا إلى جنب مع التحفيز نقص الأكسجة يدفع أكثر شدة PH النمط الظاهري2،5،6. SU5416 هو مثبط عامل النمو البطانية الوعائية (VEGF) مستقبلات-2. يمنع مستقبلات VEGF ويؤدي إلى موت الخلايا البطانية. تحت ظروف نقص الأكسجين ، وهذا يحفز انتشار مجموعة فرعية من الخلايا البطانية مقاومة لتخثر الدم. وعلاوة على ذلك, SU5416 يؤدي إلى انتشار الخلايا العضلية على نحو سلس. مزيج من هذه الآثار النتائج في إعادة عرض الأوعية الدموية الباثولوجي من الدورة الدموية الرئوية ويؤدي إلى ضغط السلطة الفلسطينية مرتفعة وإعادة عرض البطين الأيمن2,5,7. وقد وصفت النموذج الأول فيالفئران 6 وتطبيقها في وقت لاحق على الفئران4,5,7. نموذج الماوس معارض أقل شدة إعادة عرض الأوعية الدموية بالمقارنة مع الفئران. وعلاوة على ذلك، عندما عاد إلى normoxia، PH لا تزال تتقدم في الفئران، بينما في الفئران هو عكس جزئيا.
يصف البروتوكول التالي جميع الخطوات الخاصة بالنمذجة PH في الفئران باستخدام طريقة Hypoxia/SU5416 (التخطيط، الجدول الزمني، التنفيذ). بالإضافة إلى ذلك، يوصف توصيف النموذج في هذا البروتوكول: وظيفياً (من خلال قياس الضغط البطيني الأيمن (RV) باستخدام تقنية الصدر المفتوح)، بشكل مورفويرسيلي (عن طريق تشريح ووزنها على حد سواء البطينين الأيمن والأيسر)، وكذلك من الناحية النسيجية (عن طريق تقييم إعادة عرض الأوعية الدموية الرئوية، تضخم القلب البطين الأيمن والتليف).
يمكن للمحققين تنفيذ جميع الخطوات والأساليب الموصوفة في هذا البروتوكول بسهولة على أي مستوى من مستويات الخبرة. في حين أن القياسات الوظيفية للRV باستخدام تقنية الصدر المفتوح (الموصوفة هنا) ليست الطريقة القياسية الذهبية في هذا المجال ، فقد ميزة أنه يمكن تعلمها بسرعة وإعادة إنتاجها بدقة حتى من قبل تجربة أقل خبرة.
Protocol
Representative Results
Discussion
يصف هذا البروتوكول كيفية نموذج PH في الفئران عن طريق الجمع بين اثنين من المحفزات المرضية: نقص الأكسجة المزمن وحقن SU5416 (نقص الأكسجة / SU5416)18. في محاولة لربط هذا النموذج الماوس مع حالة PH الإنسان، لا بد للمرء أن ننظر حتما في تصنيف PH الحالي، هو مبين في الجدول 1. وتتميز PH في جمي?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد تم دعم هذا العمل من خلال منح من جمعية القلب الأمريكية (AHA-17SDG33370112 و 18IPA34170258) والمعاهد الوطنية للصحة المعاهد الوطنية للصحة K01 HL135474 إلى Y.S. O.B تم دعمها من قبل دويتشه هيرزستيفتونغ.
Materials
| Acetic acid glacial | Roth | 3738.1 | |
| Acetone, Histology Grade | The Lab Depot | VT110D | |
| ADVantage Pressure-Volume System | Transonic | ADV500 | |
| Bouin's solution | Sigma | Ht10132 | |
| Cautery System | Fine Science Tools | 18000-00 | |
| Connection tubing and valves | |||
| Cotton-Tipped Applicators | Covidien | 8884541300 | |
| Coverslips, 24 x50 mm | Roth | 1871 | |
| Data Acquisition and Analysis | Emka | iox2 | |
| Direct Red 80 | Sigma | 365548-5G | |
| DMSO (Dimethyl Sulfoxide) | Sigma Aldrich | 276855 | |
| Dry ice | |||
| Dumont # 5 forceps | Fine Science Tools | 11251-10 | |
| Dumont # 7 Fine Forceps | Fine Science Tools | 11274-20 | |
| Embedding molds | Sigma Aldrich | E-6032 | |
| Eosin Solution Aqueous | Sigma | HT110216 | |
| Ethanol, laboratory Grade | Carolina Biological Supply Company | 861285 | |
| Fast Green FCF | Sigma | F7252-5G | |
| Fine scissors | Fine Science Tools | 14090-09 | |
| Goat Serum | invitrogen | 16210-064 | |
| Heating pad | Gaymar | T/Pump | |
| Hematoxylin 2 | Thermo Scientific | 7231 | |
| Hypoxic chamber | Biospherix | A30274P | |
| Induction chamber | DRE Veterinary | 12570 | |
| Intubation catheter (i.v. catheter SurFlash (20 G x 1") ) | Terumo | SR*FF2025 | |
| Iris scissors | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Isoflurane | Baxter | NDC-10019-360-40 | |
| Isoflurane vaporizer | DRE Veterinary | 12432 | |
| Mice (C57BL/6) | Charles River | ||
| Needles 25 G x 5/8" | BD | 305122 | |
| OCT | Tissue Tek | 4583 | |
| PBS (Phosphate Buffered Saline) | Corning | 21-031-CV | |
| Piric Acid- Saturated Solution 1.3 % | Sigma | P6744-1GA | |
| Pressure volume catheter | Transonic | FTH-1212B-4018 | |
| Retractor | Kent Scientific | SURGI-5001 | |
| Static oxygen Controller ProOx 360 | Biospherix | P360 | |
| SU 5416 | Sigma Aldrich | S8442 | |
| Surgical Suture, black braided silk, 5.0 | Surgical Specialties Corp. | SP116 | |
| Surgical tape | 3M | 1527-1 | |
| Syringe 10 ml | BD | 303134 | |
| Syringes with needle 1 ml | BD | 309626 | |
| Sytox Green Nuclein Acid Stain | Thermo Scientific | S7020 | |
| Tenotomy scissors | Pricon | 60-521 | |
| Toluol | Roth | 9558.3 | |
| Ventilator | CWE | SAR-830/P | |
| WGA Alexa Fluor | Thermo Scientific | W11261 | |
| Xylene | Roth |
References
- Galie, N., et al. 2015 ESC/ERS Guidelines for the diagnosis and treatment of pulmonary hypertension: The Joint Task Force for the Diagnosis and Treatment of Pulmonary Hypertension of the European Society of Cardiology (ESC) and the European Respiratory Society (ERS): Endorsed by: Association for European Paediatric and Congenital Cardiology (AEPC), International Society for Heart and Lung Transplantation (ISHLT). European Heart Journal. 37 (1), 67-119 (2016).
- Stenmark, K. R., Meyrick, B., Galie, N., Mooi, W. J., McMurtry, I. F. Animal models of pulmonary arterial hypertension: the hope for etiological discovery and pharmacological cure. American Journal of Physiology-Lung Cell Molecular Physiology. 297 (6), 1013-1032 (2009).
- Maarman, G., Lecour, S., Butrous, G., Thienemann, F., Sliwa, K. A comprehensive review: the evolution of animal models in pulmonary hypertension research; are we there yet. Pulmonary Circulation. 3 (4), 739-756 (2013).
- Gomez-Arroyo, J., et al. A brief overview of mouse models of pulmonary arterial hypertension: problems and prospects. American Journal of Physiology-Lung Cell Molecular Physiology. 302 (10), 977-991 (2012).
- Ciuclan, L., et al. A novel murine model of severe pulmonary arterial hypertension. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 184 (10), 1171-1182 (2011).
- Taraseviciene-Stewart, L., et al. Inhibition of the VEGF receptor 2 combined with chronic hypoxia causes cell death-dependent pulmonary endothelial cell proliferation and severe pulmonary hypertension. FASEB Journal. 15 (2), 427-438 (2001).
- Vitali, S. H., et al. The Sugen 5416/hypoxia mouse model of pulmonary hypertension revisited: long-term follow-up. Pulmonary Circulation. 4 (4), 619-629 (2014).
- Breen, E. C., Scadeng, M., Lai, N. C., Murray, F., Bigby, T. D. Functional magnetic resonance imaging for in vivo quantification of pulmonary hypertension in the Sugen 5416/hypoxia mouse. Experimental Physiology. 102 (3), 347-353 (2017).
- Wang, Z., Schreier, D. A., Hacker, T. A., Chesler, N. C. Progressive right ventricular functional and structural changes in a mouse model of pulmonary arterial hypertension. Physiological Reports. 1 (7), 00184 (2013).
- Momcilovic, M., et al. Utilizing 18F-FDG PET/CT Imaging and Quantitative Histology to Measure Dynamic Changes in the Glucose Metabolism in Mouse Models of Lung Cancer. Journal of Visualized Experiment. (137), 57167 (2018).
- Guma, S. R., et al. Natural killer cell therapy and aerosol interleukin-2 for the treatment of osteosarcoma lung metastasis. Pediatric Blood Cancer. 61 (4), 618-626 (2014).
- Lattouf, R., et al. Picrosirius red staining: a useful tool to appraise collagen networks in normal and pathological tissues. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 62 (10), 751-758 (2014).
- Penumatsa, K. C., et al. Transglutaminase 2 in pulmonary and cardiac tissue remodeling in experimental pulmonary hypertension. American Journal of Physiology-Lung Cell Molecular Physiology. 313 (5), 752-762 (2017).
- Wang, Z., et al. Organ-level right ventricular dysfunction with preserved Frank-Starling mechanism in a mouse model of pulmonary arterial hypertension. Journal of Applied Physiology. 124 (5), 1244-1253 (2018).
- van de Veerdonk, M. C., Bogaard, H. J., Voelkel, N. F. The right ventricle and pulmonary hypertension. Heart Failure Reviews. 21 (3), 259-271 (2016).
- Emde, B., Heinen, A., Godecke, A., Bottermann, K. Wheat germ agglutinin staining as a suitable method for detection and quantification of fibrosis in cardiac tissue after myocardial infarction. European Journal of Histochemistry. 58 (4), 2448 (2014).
- Pena, S. D., Gordon, B. B., Karpati, G., Carpenter, S. Lectin histochemistry of human skeletal muscle. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 29 (4), 542-546 (1981).
- Bueno-Beti, C., Hadri, L., Hajjar, R. J., Sassi, Y. The Sugen 5416/Hypoxia Mouse Model of Pulmonary Arterial Hypertension. Methods in Molecular Biology. 1816, 243-252 (2018).
- Colvin, K. L., Yeager, M. E. Animal Models of Pulmonary Hypertension: Matching Disease Mechanisms to Etiology of the Human Disease. Journal of Pulmonary and Respiratory Medicine. 4 (4), (2014).
- Benza, R. L., et al. Predicting survival in pulmonary arterial hypertension: insights from the Registry to Evaluate Early and Long-Term Pulmonary Arterial Hypertension Disease Management (REVEAL). Circulation. 122 (2), 164-172 (2010).
- Jacob, S. W., Rosenbaum, E. E. The toxicology of dimethyl sulfoxide (DMSO). Headache. 6 (3), 127-136 (1966).
- Jacob, S. W., Wood, D. C. Dimethyl sulfoxide (DMSO). Toxicology, pharmacology, and clinical experience. American Journal of Surgery. 114 (3), 414-426 (1967).
- Abraham, D., Mao, L. Cardiac Pressure-Volume Loop Analysis Using Conductance Catheters in Mice. Journal of Visualized Experiment. (103), 52942 (2015).
- Ma, Z., Mao, L., Rajagopal, S. Hemodynamic Characterization of Rodent Models of Pulmonary Arterial Hypertension. Journal of Visualized Experiment. (110), 53335 (2016).
- Townsend, D. Measuring Pressure Volume Loops in the Mouse. Journal of Visualized Experiment. (111), 53810 (2016).
- Penumatsa, K. C., Warburton, R. R., Hill, N. S., Fanburg, B. L. CrossTalk proposal: The mouse SuHx model is a good model of pulmonary arterial hypertension. Journal of Physiology. 597 (4), 975-977 (2019).
