Imaging delle vescibole extracellulari mediante microscopia a forza atomica

Sommario

Viene descritta una procedura passo-passo per l'immobilizzazione senza etichette di esosomi e vescicoli extracellulari da campioni liquidi e la loro imaging mediante microscopia a forza atomica (AFM). Le immagini AFM vengono utilizzate per stimare le dimensioni delle vesciche nella soluzione e caratterizzare altre proprietà biofisiche.

Abstract

Gli esosomi e altre vesciche extracellulari (EV) sono complessi molecolari costituiti da una vescica della membrana lipidica, la sua decorazione superficiale da proteine della membrana e altre molecole, e diversi contenuti luminali ereditati da una cellula madre, che include RNA, proteine e DNA. La caratterizzazione delle dimensioni idrodinamiche dei VE, che dipende dalle dimensioni della vescica e dal suo strato coronale formato da decorazioni superficiali, è diventata di routine. Per gli esosomi, il più piccolo dei VE, la differenza relativa tra le dimensioni idrodinamiche e vescicle è significativa. La caratterizzazione delle dimensioni delle vesciche mediante l'imaging criogenico elettronico (crio-TEM), una tecnica gold standard, rimane una sfida a causa del costo dello strumento, delle competenze necessarie per eseguire la preparazione del campione, l'imaging e analisi dei dati, e un piccolo numero di particelle spesso osservate nelle immagini. Un'alternativa ampiamente disponibile e accessibile è la microscopia a forza atomica (AFM), in grado di produrre dati versatili sulla geometria tridimensionale, le dimensioni e altre proprietà biofisiche delle vesciche extracellulari. Il protocollo sviluppato guida gli utenti nell'utilizzare questo strumento analitico e delinea il flusso di lavoro per l'analisi dei veicoli elettrici da parte dell'AFM, che include la preparazione del campione per l'imaging dei vee EV in forma idratata o desiccata, l'immobilizzazione elettrostatica su un substrato, l'acquisizione dei dati, la sua analisi e interpretazione. I risultati rappresentativi dimostrano che la fissazione dei verisulla superficie mica modificata è prevedibile, personalizzabile e consente all'utente di ottenere risultati di dimensionamento per un gran numero di vesciche. Il dimensionamento della vescica basato sui dati AFM è risultato coerente con l'imaging crio-TEM.

Introduzione

Le vesciche extracellulari (EV) sono presenti in tutti i fluidi corporei, tra cui sangue, urina, saliva, latte e liquido amniotico. Gli esosomiti formano una classe distrettuale di veicoli elettrici differenziati dagli altri VE dalla biogenesi endosomica, dai marcatori del percorso endosomico e dalla dimensione più piccola tra tutti i veicoli elettrici. La dimensione degli esosomi è spesso riportata con una sostanziale variabilità tra gli studi. I risultati del dimensionamento sono risultati dipendenti dal metodo, riflettendo la differenza nei principi fisici impiegati da diverse tecniche analitiche per stimare le dimensioni EV^1,

Protocollo

1. Isolamento dei veicoli elettrici da un biofluido

1. Isolare gli EV con uno dei metodi stabiliti, come l'ultracentrifugazione differenziale⁸, precipitazioni o cromatografia di esclusione di dimensioni⁹.
2. Confermare la presenza di biomarcatori superficiali e luminali previsti e l'assenza di biomarcatori che indicano la contaminazione incrociata della preparazione. Confermare la morfologia del bistrato lipidico delle particelle isolate mediante microscopia elettronica.
   NOTA: quando si isolano gli esosomi, la distribuzione delle dimensioni idrodinamiche misurata dall'analisi del traccia....

Risultati

La fissazione superficiale dei veicoli elettrici è un passaggio fondamentale nella sequenza di imaging. L'immobilizzazione elettrostatica della superficie degli esosomi, nota per avere un potenziale zeta negativo, si verificherà in modo robusto dopo che il substrato della mica viene modificato per avere una carica superficiale positiva. Senza il trattamento con NiCl₂ per impartire cambiamenti positivi di superficie, l'immobilizzazione dei veli sul substrato è risultata inefficace. L'immagine dell'altezza in

Discussione

L'immobilizzazione dei veicoli elettrici da un fluido biologico, la scansione superficiale e l'analisi delle immagini sono i passi essenziali del protocollo sviluppato per la caratterizzazione AFM dei veicoli elettrici in liquido. Il numero di vesciche suscettibili di imaging AFM scala con la superficie di immagine e la concentrazione superficiale delle vesciche immobilizzate sul substrato. Dato un potenziale zeta negativo di espeeedanti¹⁸, sosteniamo la fissazione elettrostatica dei veicoli elett.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Controllore AFM/STM	Bruker	Multimode Nanoscope V	Questo controller AFM supporta l'imaging di campioni biologici in liquidi e aria.
Dischi per campioni in metallo AFM/STM (10 mm)	TedPella	16207	Disco per campioni in metallo su cui un disco di mica è fissato con un nastro biadesivo o altri mezzi.
Dischi di mica AFM/STM (10 mm)	TedPella	50	Mica V1 di altissima qualità, spessore 0,21 mm (0,0085"). Interfogliato, in confezioni da 10. Può essere montato su dischi AFM/STM. Disponibile in quattro diametri
Sonda AFM per l'imaging in aria	Bruker	TESP-V2	Sonde in silicone inciso di alta qualità per la modalità di maschiatura e la modalità senza contatto per la scansione in aria.
Sonda AFM per l'imaging di campioni morbidi in Bruker		MLCT	liquido Cantilever in nitruro di silicio morbido con punte in nitruro di silicio, che sono adatti per il funzionamento a liquido. L'intervallo delle costanti di forza consente agli utenti di visualizzare campioni estremamente morbidi in modalità contatto e di spettroscopia ad alto carico rispetto alla distanza.
Nastro biadesivo	Spectrum	360-77705	Utilizzato per fissare il disco di mica sul disco del campione di metallo.
ExoQuick-TC	System Biosciences	EXOTC50A-1	ExoQuick-TC è un kit proprietario a base di polimeri progettato per l'isolamento degli esosomi dai terreni di coltura tissutale.
Supporto AFM sonda in vetro per imaging in liquido	Bruker	MTFML-V2	Questo supporto per sonda in vetro è progettato per la scansione in fluidi con l'AFM multimodale. Il supporto può essere utilizzato in modalità di spillatura della forza di picco, modalità di contatto, modalità di maschiatura e modulazione della forza. La sonda è azionata acusticamente da un oscillatore piezoelettrico separato per una modulazione di ampiezza maggiore. Il supporto viene fornito con due porte, i raccordi necessari e il kit di accessori per l'aggiunta e la rimozione dei fluidi.
Istituto di metrologia ceco	di Gwyddion	Versione 2.52	Software Open Source per la visualizzazione e l'analisi di campi dati ottenuti mediante tecniche di microscopia a scansione di sonda.
Carta assorbente priva di lanugine	GE Healthcare Whatman	Grado GB003 Carta assorbente	Utilizzare questa carta assorbente per rimuovere NiCl2 dopo la modifica del substrato della mica.
Salviette per camere bianche prive di lanugine	Texwipe	AlphaWipe TX1004	Usa queste salviette in poliestere per la pulizia delle superfici.
Cloruro di nichel (II) (NiCl2)	Sigma-Aldrich	339350	Polvere utilizzata per produrre 10 mM di NiCl2 in acqua deionizzata
Soluzione salina tamponata con fosfato (1x)	Gibco	10010023	PBS, pH 7,4

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