Visualisation du sillon oculaire supérieure durant l’embryogenèse Danio rerio
Summary
Nous présentons ici une série standardisée des protocoles d’observer le sillon oculaire supérieur, une structure récemment identifiés, évolutivement conservée dans le œil de vertébrés. À l’aide de larves de poisson zèbre, nous démontrons techniques nécessaires pour identifier les facteurs qui contribuent à la formation et la fermeture du sillon oculaire supérieur.
Abstract
Colobome oculaire congénital est une maladie génétique qui est généralement observée comme une fissure dans l’aspect inférieur de le œil résultant de la fermeture incomplète fissure choroïde. Récemment, l’identification des individus avec colobome dans l’aspect supérieur de l’iris, rétine et lentille a conduit à la découverte d’une nouvelle structure, dénommée la fissure supérieure ou sillon oculaire supérieur (SOS), qui est transitoirement présent sur la partie dorsale aspect de la cupule optique au cours du développement de le œil de vertébrés. Bien que cette structure est conservée à travers la souris, poulet, poisson et newt, notre compréhension actuelle du re est limitée. Afin d’élucider les facteurs qui contribuent à sa formation et de la fermeture, il est impératif de pouvoir observer et identifier les anomalies, tels que le retard dans la fermeture du re. Ici, nous avons décidé de créer une série normalisée de protocoles qui permet de visualiser efficacement le SOS en combinant des techniques de microscopie largement disponibles avec des techniques de biologie moléculaire commun tels que la coloration par immunofluorescence et ARNm surexpression. Bien que cet ensemble de protocoles porte sur la possibilité d’observer le retard de fermeture de SOS, il s’adapte aux besoins de l’expérimentateur et peut être facilement modifié. Dans l’ensemble, nous espérons créer une méthode accessible à travers lequel notre compréhension du re peut être avancée afin d’élargir les connaissances actuelles du développement de le œil de vertébrés.
Introduction
La formation de le œil de vertébrés est un processus hautement conservé dans lequel les voies de signalisation intercellulaires soigneusement orchestrées établissent les types de tissus et spécifient l’identité régionale1. Perturbations au début morphogenèse oeil entraîner des défauts profonds à l’architecture de le œil et sont fréquemment aveuglantes2. Une telle maladie résulte de l’omission de fermer la fissure choroïde oculaire dans la partie ventrale de la cupule optique3. Cette affection, appelée colobome oculaire, est estimée à se produire dans 1 sur 4-5000 naissances vivantes et cause 3 à 11 % de la cécité pédiatrique, communément se manifestant par une structure de type trou de serrure qui fait saillie inférieurement de l’élève au centre de l’oeil4, 5,6. La fonction de la fissure choroïde est de fournir un point d’entrée pour début vascularisation de plus en plus dans la cupule optique, après quoi les côtés de la fissure vont se fusionnent pour enfermer les vaisseaux7.
Alors que le colobome oculaire est connu depuis les temps anciens, nous avons récemment identifié un nouveau sous-ensemble de colobome patients avec perte de tissu qui affectent l’aspect supérieur/dorsale de le œil. Des travaux récents dans notre laboratoire a conduit à la découverte d’une structure oculaire dans le œil de poisson-zèbre dorsale, que nous appelons le sillon oculaire supérieur (SOS) ou fissure supérieure8. Il est important de noter que la structure présente des caractéristiques d’un sillon tant une fissure. Semblable à un sillon, c’est une couche de tissu continu qui s’étend de la nasale de la rétine temporale. En outre, la fermeture de la structure n’est pas véhiculée par une fusion des deux s’opposant à membrane basale, et il semble avoir besoin d’un processus morphogénétique par lequel la structure est remplie de cellules. Cependant, comme dans une fissure, il forme une structure qui sépare les parties nasales et temporelles de le œil dorsale avec la membrane basale. Par souci de cohérence, nous appellerons à elle comme SOS dans ce texte.
Le SOS est évolutivement conservée à travers des vertébrés, étant visible durant la morphogenèse oeil de poisson, poussin, Triton et souris8. Contrairement à la fissure choroïde, qui est présente de 20 à 60 heures après la fécondation (hpf) chez le poisson zèbre, le SOS est très transitoire, étant facilement visible de 20-23 hpf et absent par 26 hpf8. Des études récentes dans notre laboratoire ont révélé que, semblable à la fissure choroïde, le SOS joue un rôle dans une conduite vasculaire au cours de le œil la morphogenèse8. Bien que les facteurs qui contrôlent la formation et la fermeture du re ne sont pas encore totalement comprises, nos données mettent en évidence les rôles pour oeil dorsal-ventral patterning gènes8.
Poisson zèbre est un organisme d’excellent modèle pour étudier la SOS. Comme système modèle, il fournit un certain nombre d’avantages dans l’étude de développement de le œil : C’est un modèle de vertébrés ; chaque génération présente forte fécondité (~ 200 embryons) ; son génome a été entièrement séquencé, ce qui facilite la manipulation génétique ; et environ 70 % des gènes humains ont au moins un orthologue de poisson-zèbre, ce qui en fait un modèle idéal de base génétique des maladies humaines9,10. Plus important encore, son développement se déroule à l’extérieur à la mère, et ses larves sont transparentes, ce qui permet la visualisation de le œil en développement avec la facilité relative de11.
Dans cet ensemble de protocoles, les auteurs décrivent les techniques à travers lequel le SOS peuvent être visualisées dans des larves de poisson zèbre. La variété des techniques de visualisation utilisé dans le présent rapport permettra l’observation claire du re au cours du développement de l’oeil normal, ainsi que la capacité de détecter les défauts de fermeture de SOS. Nos protocoles d’exemple mettra en vedette des enquêtes de Gdf6, un BMP localisée à la partie dorsale oeil et régulateur connu de fermeture de SOS. En outre, ces techniques peuvent être associés à des manipulations expérimentales afin d’identifier les facteurs génétiques ou des agents pharmacologiques qui affectent la fermeture et la bonne formation de SOS. En outre, nous avons inclus un protocole par lequel l’imagerie fluorescente de toutes les membranes cellulaires est possible, permettant à l’expérimentateur d’observer les changements morphologiques pour les cellules qui entourent les SOS. Notre objectif est d’établir un ensemble de protocoles normalisés qui permet d’offrir de nouvelles perspectives sur cette nouvelle structure de l’oeil en développement dans l’ensemble de la communauté scientifique.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nous présentons ici une série standardisée des protocoles d’observer les SOS dans l’embryon de poisson zèbre en développement. Pour déterminer les phénotypes de retard fermeture, nos protocoles ont mis l’accent sur la capacité de distinguer la séparation de deux lobes distincts des côtés dorsal-nasal et dorsale-temporal de le œil, semblable aux techniques permettant de visualiser le retard de fermeture de fissure choroïde phénotypes dans l’oeil ventral.
Ces techniques de …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par les instituts de recherche en santé du Canada (IRSC), Sciences naturelles et Conseil de recherches en génie (CRSNG), Alberta Innovates Technology Futures et les femmes et Health Research Institute (WCHRI enfants).
Materials
| 1-phenyl 2-thiourea | Sigma Aldrich | P7629-10G | |
| 100 mm Petri dish | Fisher Scientific | FB0875713 | |
| 35 mm Petri dish | Corning | CLS430588 | |
| Agarose | BioShop Canada Inc. | AGA001.1 | |
| Bovine serum albumin | Sigma Aldrich | A7906-100G | |
| DIC/Fluorescence microscope | Zeiss | AxioImager Z1 | |
| Dissection microscope | Olympus | SZX12 | |
| Dissection microscope camera | Qimaging | MicroPublisher 5.0 RTV | |
| Dow Corning High-vacuum grease | Fisher Scientific | 14-635-5D | |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt (Tricaine) | Sigma Aldrich | A5040-25G | |
| Goat anti-rabbit Alexa Fluor 488 | Abcam | ab150077 | |
| Goat serum | Sigma Aldrich | G9023 | |
| Image capture software | Zeiss | ZEN | |
| Incubator | VWR | Model 1545 | |
| Microscope Cover Glass (22 mm x 22 mm) | Fisher Scientific | 12-542B | |
| Microscope slide | Fisher Scientific | 12-544-2 | |
| Minutien pin | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| mMessage mMachine Sp6 Transcription Kit | Invitrogen | AM1340 | |
| NotI | New England Biolabs | R0189S | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma Aldrich | P6148-500G | |
| Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol pH 6.7 +/- 0.2 | Fisher Scientific | BP1752-100 | |
| Proteinase K | Sigma Aldrich | P4850 | |
| Rabbit anti-laminin antibody | Millipore Sigma | L9393 | |
| TURBO Dnase (2 U/µL) | Invitrogen | AM2238 | |
| Ultrapure low-melting point agarose | Invitrogen | 16520-100 | |
| UltraPure Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Invitrogen | 15525017 |
Riferimenti
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