Visualisering af Superior okulær Sulcus under Danio rerio embryogenese

Summary

Vi præsenterer her, en standardiseret række protokoller at observere den overlegne okulære sulcus, en nylig identificeret, evolutionært bevaret struktur i hvirveldyr øje. Bruger zebrafisk larver, vise vi teknikker nødvendige for at identificere faktorer, der bidrager til dannelse og lukning af den overlegne okulære sulcus.

Abstract

Medfødt okulær coloboma er en genetisk lidelse, der er typisk bemærket som en kløft i ringere aspekt af øjet som følge af ufuldstændig plexus revne lukning. For nylig, identifikation af personer med coloboma i den overlegne aspekt af iris, nethinden, og linse førte til opdagelsen af en ny struktur, omtales som den overlegne revne eller superior okulær sulcus (SOS), der er forbigående til stede på den dorsale aspekt af den optiske kop under hvirveldyr øje udvikling. Selv om denne struktur er bevaret på tværs af mus, kylling, fisk og newt, er vores nuværende forståelse af SOS begrænset. For at belyse faktorer, der bidrager til dens dannelse og lukning, er det bydende nødvendigt at kunne observere det og identificere abnormiteter, såsom forsinkelse i lukningen af SOS. Her, satte vi sig for at skabe en standardiseret serie af protokoller, der kan bruges til at effektivt visualisere SOS ved at kombinere bredt tilgængelige mikroskopi-teknikker med fælles molekylærbiologiske teknikker såsom immunfluorescent farvning og mRNA overekspression. Mens dette sæt af protokoller, der fokuserer på evnen til at iagttage SOS lukning forsinkelse, det kan tilpasses til eksperimentatorens behov og nemt kan redigeres. Samlet set håber vi at skabe en imødekommende metode, hvorigennem vores forståelse af SOS kan være avanceret for at udvide den nuværende viden om hvirveldyr øje udvikling.

Introduction

Dannelsen af de hvirveldyr øje er en yderst velbevarede proces hvor omhyggeligt orkestreret intercellulære signaling veje etablere vævstyper og angive regionale identitet¹. Perturbationer til tidlig øje morfogenese medføre dybtgående defekter på arkitekturen i øjet og blændende ofte². En sådan sygdom skyldes undladelse af at lukke den plexus okulære revne i den ventrale side af optik cup³. Denne lidelse, kendt som okulær coloboma, skønnes for at forekomme i 1 ud af 4-5000 levendefødte og årsag 3-11% af pediatric blindhed, almindeligt manifesterer sig som et nøglehul-lignende struktur, der stikker inferiorly fra elev i midten af øjet^{4, 5,6}. Den plexus revne funktion er at give et indgangspunkt for tidlige Vaskulaturen vokser ind i optiske kop, hvorefter siderne af revne vil sammensmelte for at omslutte fartøjer⁷.

Mens okulær coloboma har været kendt siden oldtiden, har vi for nylig identificeret en roman undersæt af coloboma patienter med væv tab påvirker den superior/dorsale del af øjet. Seneste arbejde i vores lab har ført til opdagelsen af en okulær struktur i zebrafisk dorsale øje, som vi refererer til som den overlegne okulær sulcus (SOS) eller overlegne revne⁸. Det er vigtigt at bemærke, at strukturen har karakteristika af både en sulcus og en revne. Svarende til en sulcus, det er en løbende væv lag, der strækker sig fra nasale til tidsmæssige nethinden. Derudover lukningen af strukturen er ikke formidlet af en fusion af de to modsatrettede basalmembranen, og det synes at kræve en morfogenetiske proces som strukturen er befolket af celler. Dog ligner en revne, det udgør en struktur, der adskiller de nasale og tidsmæssige sider af den dorsale øje med basalmembranen. For konsistens, vil vi henvise til det som SOS i denne tekst.

SOS er evolutionært bevaret på tværs af hvirveldyr, kan ses under øjet morfogenese i fisk, kylling, newt og mus⁸. I modsætning til den plexus revne, som er til stede fra 20-60 timer efter befrugtningen (hpf) i zebrafisk, SOS er meget flygtig, at være let synlige fra 20-23 hpf og fraværende af 26 hpf⁸. Nyere forskning i vores lab har fundet, at ligner den plexus revne, SOS spiller en rolle i vaskulære vejledning under øjet morfogenese⁸. Selv om de faktorer, der styrer dannelsen og lukning af SOS ikke er endnu fuldt forstået, vores data fremhæve roller for dorsal-ventral øjet mønster gener⁸.

Zebrafisk er en fremragende model organisme at studere SOS. Som en modelsystem, det giver en række fordele i at studere øjet udvikling: det er en hvirveldyr model; hver generation udstiller høj frugtbarhed (~ 200 embryoner); dens genom har været fuldt sekventeret, som letter genetisk manipulation; og ca. 70% af menneskelige gener har mindst én zebrafisk orthologue, hvilket gør det en ideel genetik-baseret model for menneskelig sygdom^9,10. Vigtigst, dens udvikling finder sted eksternt til moderen, og dens larver er gennemsigtig, hvilket giver mulighed for visualisering af den tredje øjet med relativ lethed¹¹.

I dette sæt af protokoller beskriver vi de teknikker, gennem hvilke SOS kan visualiseres i zebrafisk larver. Vifte af visualiseringsteknikker, der anvendes i denne rapport vil give mulighed for klart observation af SOS under normale øjes udvikling, såvel som evnen til at opdage SOS lukning fejl. Vores eksempel protokoller vil indslag undersøgelser af Gdf6, en BMP lokaliseret til den dorsale øje og kendte regulator af SOS lukning. Yderligere, disse teknikker kan kombineres med eksperimentelle manipulationer til at identificere genetiske faktorer eller farmakologiske stoffer, der påvirker ordentlig SOS dannelse og lukning. Derudover har vi inkluderet en protokol, hvorigennem de fluorescerende billeddannelse af alle cellemembraner er muligt, tillader eksperimentatoren at observere morfologiske ændringer i cellerne omkring SOS. Vores mål er at etablere et sæt standardiserede protokoller, der kan bruges i hele den videnskabelige samfund til at tilbyde nye indsigter i denne nye struktur af det tredje øje.

Protocol

Alle metoder beskrevet her er blevet godkendt af University of Alberta Animal Care og brug udvalget. 1. protokol 1: Visualisering af SOS ved hjælp af stereomicroscopy og differential interferens kontrast (DIC) imaging Embryonerne blev indsamlet I en tank af dechlorinated vand, forberede krydsninger af gdf6a+/- zebrafisk om aftenen ved at parre en mandlig zebrafisk med en kvindelig zebrafisk. Sørg for at adskille mandlige fra kvinden ved hjælp af en ski…

Representative Results

Zebrafisk SOS vises på 20 hpf i den formodede dorsale nethinde8. 23 hpf SOS overgange fra sin oprindelige arkitektur, smalle til en bred fordybning og 26 hpf det er ikke længere synlig8. Derfor, for at undersøge SOS under normale zebrafisk øje udvikling, at embryonerne skal overholdes mellem 20-23 hpf. I denne periode er SOS observerbare gennem dissekere mikroskop og via DIC imaging som en tynd linje i den dorsale øje, der adskiller de …

Discussion

Her præsenterer vi en standardiseret række protokoller at observere SOS i udviklingslandene zebrafisk embryo. For at bestemme lukning forsinkelse fænotyper, har vores protokoller fokuseret på evnen til at skelne adskillelse af to diskrete lapper i de dorsale nasal og dorsal-temporale sider af øjet, svarende til teknikker, der anvendes til at visualisere plexus revne lukning forsinkelse fænotyper i ventrale øjet.

Disse visualiseringsteknikker kan bruges sammen med en række genetiske man…

Materials

1-phenyl 2-thiourea	Sigma Aldrich	P7629-10G
100 mm Petri dish	Fisher Scientific	FB0875713
35 mm Petri dish	Corning	CLS430588
Agarose	BioShop Canada Inc.	AGA001.1
Bovine serum albumin	Sigma Aldrich	A7906-100G
DIC/Fluorescence microscope	Zeiss	AxioImager Z1
Dissection microscope	Olympus	SZX12
Dissection microscope camera	Qimaging	MicroPublisher 5.0 RTV
Dow Corning High-vacuum grease	Fisher Scientific	14-635-5D
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt (Tricaine)	Sigma Aldrich	A5040-25G
Goat anti-rabbit Alexa Fluor 488	Abcam	ab150077
Goat serum	Sigma Aldrich	G9023
Image capture software	Zeiss	ZEN
Incubator	VWR	Model 1545
Microscope Cover Glass (22 mm x 22 mm)	Fisher Scientific	12-542B
Microscope slide	Fisher Scientific	12-544-2
Minutien pin	Fine Science Tools	26002-10
mMessage mMachine Sp6 Transcription Kit	Invitrogen	AM1340
NotI	New England Biolabs	R0189S
Paraformaldehyde (PFA)	Sigma Aldrich	P6148-500G
Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol pH 6.7 +/- 0.2	Fisher Scientific	BP1752-100
Proteinase K	Sigma Aldrich	P4850
Rabbit anti-laminin antibody	Millipore Sigma	L9393
TURBO Dnase (2 U/µL)	Invitrogen	AM2238
Ultrapure low-melting point agarose	Invitrogen	16520-100
UltraPure Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)	Invitrogen	15525017