פרוטוקול זה מדגים הניתוח קומפלקסי שרשרת הנשימה מיטוכונדריאלי מאת כחול מקורי לזיהוי בג’ל. כאן מתוארת השיטה להחיל בתרבית תאים אנושיים.
נשימה מיטוכונדריאלי מתבצע על ידי זרחון חמצוני (OXPHOS) מתחמי בתוך המיטוכונדריה. גורמים פנימיים וסביבתיים יכול perturb את מכלול והיציבות של מתחמי OXPHOS. פרוטוקול זה מתאר את הניתוח קומפלקסי שרשרת הנשימה מיטוכונדריאלי מאת כחול מקורי לזיהוי בג’ל (בסון-עמוד) ביישום בתרבית תאים אנושיים. ראשית, המיטוכונדריה מופקים מן התאים באמצעות digitonin, ולאחר מכן באמצעות לאוריל maltoside, מתחמי OXPHOS שלמים הם בודדו אותנו מהמתרחש הממברנות מיטוכונדריאלי. מתחמי OXPHOS ואז נפתרות על ידי אלקטרופורזה בג’ל הדרגתיות בנוכחות לצבוע טעונים שלילית, Coomassie כחול, אשר מונעת צבירת חלבון ומבטיחה ניידות electrophoretic של חלבון מתחמי לכיוון הקתודה. בסופו של דבר, מתחמי OXPHOS מזוהים לפי תקן immunoblotting. לפיכך, בסון-דף היא שיטה נוחה וזולה יכול לשמש כדי להעריך את מכלול של כל מתחמי OXPHOS, בניגוד בסיסי מרחביות-הדף המאפשר לימוד רק בודדים OXPHOS מורכבים subunits.
המיטוכונדריה הם רב תכליתיים organelles משחקת תפקיד חשוב בייצור אנרגיה, ויסות חילוף החומרים הסלולר, איתות, אפופטוזיס, הזדקנות,2,‘1,וכו ‘3. ייצור האנרגיה בתוך המיטוכונדריה מסתמך על הפונקציה זרחון חמצוני זוגות נשימה עם סינתזת ATP. בתאי האדם, מערכת זרחון חמצוני מיטוכונדריאלי (OXPHOS) מורכב חמישה מתחמי. מתחמי I-IV ליצור מעבר פרוטון אלקטרוכימי של החלל intermembrane מיטוכונדריאלי המשמש V מורכבים כדי לייצר ATP. כל OXPHOS מורכבים multimeric, למעט השני מורכב, המורכב subunits מקודד על ידי גרעיני והן מיטוכונדריאלי הגנים. פגמים במרכיבי הליבה של מתחמי OXPHOS נגרמת על ידי מוטציות או עקה יכול perturb את ההרכבה ואת הפונקציונליות של המערכת זרחון חמצוני. בנוסף, הרכבה נכונה של קומפלקסים OXPHOS תפקודית דורש מספר רב של מכלול גורמים4,5,6.
כחול מקורי לזיהוי בג’ל (בסון-עמוד) היא טכניקה בסיסי המאפשר ניתוח של מתחמי חלבון שלם והוא יכול לשמש כדי ללמוד את מכלול של מתחמי OXPHOS. ראשית, המיטוכונדריה מבודדים את התאים על-ידי digitonin, שזה חומר ניקוי עדין זה permeabilizes קרום פלזמה של התאים. לאחר מכן, באמצעות לאוריל maltoside, מתחמי OXPHOS משתחררים מן מיטוכונדריאלי בקרום. על ידי שימוש בג’ל הדרגתי, מתחמי OXPHOS מופרדים לפי המסה שלהם. Coomassie כחול G-250 (לא R-250) נוספו למאגר דגימה, המאגר קטודית כחול dissociates אגודות דטרגנט-יציב אבל שומרת על שרשרת הנשימה בודדים קומפלקסים שלמים8. במהלך אלקטרופורזה, המאגר קטודית כחול המכיל צבע מוחלף על-ידי המאגר קטודית ללא צבע, אשר מבטיח העברה יעילה של מתחמי OXPHOS קרום PVDF8. כדי להמחיש OXPHOS תסביכים, קרום PVDF מודגרת ברצף עם נוגדנים המתאימים subunits הנבחר של מתחמי OXPHOS חמש.
ניתן להחיל את השיטה המתוארת כאן עם כמה שיפורים לתאים בתרבית. בנוסף, שיטה זו יכול לשמש לניתוח של מתחמי OXPHOS המיטוכונדריה מבודד דגימות רקמה9. בסון-דף דורש לפחות 5-10 µg של המיטוכונדריה עבור כל דגימה לכל הפעלה. באמצעות השיטה המתוארת כאן, 500,000 תרבותי תאים כגון HEK293, SH-SY5Y או 143B תאים המסוגלים להניב כ 10 µg של המיטוכונדריה. עם זאת, כמות מספקת של התאים לניתוח בסון תלוי בסוג תא ספציפי.
השיטה הנפוצה ביותר ללמוד חלבונים OXPHOS מיטוכונדריאלי הוא מרחביות-דף סופג המערבי. עם זאת, למען חברה דמוקרטית-דף מאפשר ללמוד רק בודדים subunits OXPHOS, בניגוד בסון-דף, לא ניתן להשתמש כדי להעריך את מכלול של כל מתחמי OXPHOS. יליד ברורה-דף מפריד חלבון מתחמי בתנאים מקורי ללא הנוכחות של צבע טעונים שלילית, יש ברזולוציה נמוכה יותר באופן משמעותי בהשוואה בסון-דף. עם זאת, ברור מקורי-דף הוא מתון יותר מאשר בסון-דף כך שיוכל לשמור יציב מכלולים סופרא מולקולרית של מתחמי חלבון כגון supercomplexes OXPHOS כי הם חלופה מועדפת תחת תנאים בסון-דף10. פרוטוקול זה, הג’ל מעבר צבע משמש כדי להפריד בין מתחמי; אולם, לחלופין, הפרדת צבע שאינו יכול לשמש אם הבורא הדרגתיות יקרה יחסית אינה זמינה11.
חשוב, השיטה המתוארת כאן המאפשר לנתח את מכלול של מתחמי OXPHOS, בעוד הפונקציונליות של מתחמי לא מוערך. ברזולוציה גבוהה בסון-עמוד ולאחריו פעילות בג’ל assay11 , כמו גם פעילות אנזימטי spectrophotometric assay מתחמי מיטוכונדריאלי12 הם יעילים טכניקות לניתוח פונקציונלי של מתחמי OXPHOS. עם זאת, שתי השיטות הללו לא assay ההרכבה של קומפלקסים OXPHOS.
לפיכך, בסון-דף היא השיטה האופטימלית כדי לחקור את מכלול של מתחמי OXPHOS בודדים. לדוגמה, כמה הפרעות מיטוכונדריות, כגון לבר תורשתי אופטיים נוירופתיה (LHON), אנצפלופתיה מיטוכונדריאלי עם חמצת לקטית, מיטוכונדרית (מילס), קשורים עם הרכבה מסולף של רכיב אחד או יותר של OXPHOS מערכת5. באמצעות השיטה בסון-דף המתוארת כאן, המנגנונים המולקולריים של מחלות מיטוכונדריאלי יכול להילמד.
אחד החלקים הקריטיים ביותר של הפרוטוקול היא לשמר את שלמות מכלולי OXPHOS במהלך הכנת הדוגמא, אחסון ג’ל אלקטרופורזה. לפיכך, המיטוכונדריה הנשאים ב +4 ° C, הדגימות לא צריך לעבור מחזורים ההקפאה-הפשרה. OXPHOS מתחמי יכול לסבול רק מחזור אחד הפשרת ההקפאה במהלך כל התהליך. מספר מחזורים ההקפאה-הפשרה להשמיד את מתחמי OXPHOS (איור 1B). שליטה ודוגמאות ניסיוני כי הם להיות מושווה כדאי להיערך במקביל כדי למנוע כל ההבדלים בתנאי אחסון, אשר עשוי לתת תוצאות מטעות. אם זה לא אפשרי לבצע את כל השלבים של הפרוטוקול במקביל עם כל הדגימות, מומלץ להקפיא תא שטף כדורי ב-80 מעלות צלזיוס (שלב 1.4 ב פרוטוקול זה) ולבצע לאחר מכן שאר הפרוטוקול עבור כל הדגימות ביחד לפחות עד gel רצועות, זרוע צולבות trophoresis. תשומת לב מיוחדת צריך להיות משולם את ניקיון המנגנון אלקטרופורזה (טנק, קלטות). אם המנגנון זהה עבור מרחביות-דף, לשטוף אותו היטב לפני בסון-דף. כל מרחביות שיורית יכול לגרום דיסוציאציה של מתחמי OXPHOS במהלך אלקטרופורזה.
ג’לים מעבר צבע באיכות גבוהה הם חלק קריטי נוסף של הפרוטוקול. ג’לים precast עבור דף מקורי כחול הם זמינים מסחרית; עם זאת, לא מומלץ להשתמש בהם, מאז המאגרים המשמש ג’לים מסחרי יכול להיות בהרכב, אשר שונה מן המאגרים הדגימה. מעבר הצבע של הג’ל המשמש כאן (6-15%) הוא אופטימלי ההפרדה של מתחמי OXPHOS בודדים. כדי לזהות מבנים סופרא מולקולרית מסדר גבוה של OXPHOS, שרשרת הנשימה הידוע גם supercomplexes14, קצת אופטימיזציה הוא נדרש11.
החזיית OXPHOS מתחמי לשימוש נוגדנים ספציפיים ברצף, על בסיס המאפיינים שלהם. לדוגמה, השתמש תחילה נוגדן זה נותן את האות החלש ביותר של הנוגדן עם האות החזק ביותר לאחרונה. זה חשוב מאז פירוק מחליש את הזיהוי (איור 1D). ההרכב של קומפלקסי שרשרת הנשימה יכול ייחקרו אם אחרי בסון-עמוד הג’ל הוא נתון את המימד השני מרחביות-עמוד15.
הפרוטוקול המתואר כאן מרמז באמצעות נוגדנים נגד קומפלקסים OXPHOS בודדים ברצף. עם זאת, הנוגדן OXPHOS זמינים מסחרית קוקטייל יכול לשמש כדי לזהות כל מכלולי OXPHOS חמש בו זמנית. ובכל זאת, כדי שתוכל לזהות שהיישום שהורכב קומפלקסים OXPHOS ולהגדיר את זהותם, נוגדנים נגד קומפלקסים OXPHOS בודדים יש להשתמש ברצף. השלב זה זמן רב; עם זאת, זה יכול להיות חיוני לבדיקה תנאים חדשים ניסויית ומודלים.
הריכוז של digitonin המשמש לבידוד מיטוכונדריאלי צריך אופטימיזציה עבור סוג תאים מסוים. כמו חומר ניקוי, digitonin permeabilizes קרום התא. ריכוז אופטימלי של digitonin permeabilizes ביעילות קרום פלזמה של התאים עוזב את הקרומים מיטוכונדריאלי ללא פגע. ריכוז נמוך מדי של digitonin גורם זיהום גבוה של תמציות מיטוכונדריאלי בזמן ריכוז גבוה מדי נזק מיטוכונדריאלי בקרום ומפחית את התשואה מיטוכונדריאלי הכולל. היחס האופטימלי digitonin/חלבון (g/g) משתנה בין 0.3 ל- 1. תספיג חלבון ניתוח של חלבונים מופק כדורי, supernatants יכול לשמש כדי לבדוק את ריכוז אופטימלי digitonin16.
פרוטוקול זה אינו כולל חלבון טעינת פקד immunoblot; לכן, ריכוז חלבון של מתחמי שחולצו יש בקפידה למדוד לפחות triplicates כדי להבטיח הטעינה שווה. בנוסף, ניתן להפעיל את הדגימות בדף-בסון ב משכפל. אם ההרכבה של קומפלקסים OXPHOS סלקטיבי הוא לקוי, מתחמי לא מושפע יכול לשמש טעינת פקדים.
ההערכה של המסה המולקולרית של מתחמי חלבון בסון-בדף הוא מאתגר18. בפרוטוקול הנוכחי אינו כולל את סמן משקל מולקולרי; לכן, כדי להעריך את מכלול של מתחמי OXPHOS, הדגימות פקד המכיל מתחמי לא מושפע תמיד להיכלל הניתוח. הדגימות הבקרה עבור בסון-דף בדרך כלל אינו מטופל או פראי סוג התאים.
השיטה המוצגת כאן ממוטב עבור הגילוי של קומפלקסי שרשרת הנשימה מיטוכונדריאלי; עם זאת, ניתן גם להחיל אותה על ההערכה של oligomerization של חלבונים מיטוכונדריאלי19. בנוסף, שיעור הרכבה של קומפלקסים OXPHOS ניתן יהיה ללמוד על ידי הראשון depleting מיטוכונדריאלי מקודד יחידת משנה המכיל מתחמי כלורמפניקול, ואז בעקבות התאוששות שלהם לאחר הסרת כלורמפניקול10. לפיכך, בסון-דף יכול לשמש כדי להעריך את מצב יציב רמות והרכבה של OXPHOS עבור יישומים שונים כולל אבחון מולקולרי של הפרעות מיטוכונדריות האנושי9,11.
The authors have nothing to disclose.
ספריית אוניברסיטת הלסינקי הוא הודה על התמיכה הכלכלית בהוצאה לאור.
100 mm cell plates | Thermo Fisher Scientific | 130182 | |
40% Acrylamide/Bis 37.5:1 | Bio-Rad | 161-0148 | |
Aminocaproic acid | Sigma | A2504 | |
Ammonium persulfate | Sigma | A3678 | |
Anti-ATP5A | Abcam | 14748 | Complex V subunit |
Anti-MTCOI | Abcam | 14705 | Complex VI subunit |
Anti-NDUFA9 | Abcam | 14713 | Complex I subunit |
Anti-SDHA | Abcam | 14715 | Complex II subunit |
Anti-UQCRC2 | Abcam | 14745 | Complex III subunit |
Bis-tris | Sigma | B7535 | |
Bradford protein assay kit | BioRad | 5000006 | |
Cell scrapers | Fisher | 11597692 | |
Coomassie blue G250 (Serva Blue G) | Serva | 35050 | |
Digitonin | Sigma | D141 | |
DMEM | Lonza | 12-614F/12 | |
EDTA | Life Technologies | 15575-038 | |
FBS | Life Technologies | 10270106 | |
Fetal bovine serum | Life Technologies | 10270106 | |
Glycerol | (Sigma | G5516 | |
Gradient maker | Bio-Rad | 1654120 | |
Lauryl maltoside (n-Dodecyl β-D-maltoside) | Sigma | D4641 | |
L-glutamine | Life Technologies | 25030024 | |
L-glutamine | Gibco | 25030 | |
N,N,N′,N′-Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Sigma | T9281 | |
PBS | Life Technologies | BE17-516F | |
Penicillin/Streptomycin | Lonza | 17-602E | |
Penicillin/streptomycin | Gibco | 15140 | |
Power supply | GE Healthcare | EPS 301 | |
Protease inhibitors | Thermo Scientific | 10137963 | |
Trans-blot turbo mini PVDF | BioRad | 1704156 | |
Tricine | Sigma | T9784 | |
Trypsin-EDTA | Gibco | 15400054 | |
Vertical electrophoresis apparatus | BioRad | 1658004 |