इस प्रोटोकॉल ब्लू देशी polyacrylamide जेल ट्रो द्वारा mitochondrial श्वसन श्रृंखला परिसरों के विश्लेषण को दर्शाता है । यहाँ कल्चरल ह्यूमन सेल में लागू की गई विधि बताई गई है.
Mitochondrial श्वसन mitochondria के भीतर ऑक्सीडेटिव फास्फारिलीकरण (OXPHOS) परिसरों द्वारा किया जाता है । आंतरिक और पर्यावरणीय कारकों OXPHOS परिसरों की विधानसभा और स्थिरता perturb कर सकते हैं । इस प्रोटोकॉल का वर्णन ब्लू नेटिव polyacrylamide जेल ट्रो (बीएन-PAGE) द्वारा mitochondrial श्वसन श्रृंखला परिसरों के विश्लेषण में कल्चरल मानव कोशिकाओं के लिए आवेदन । सबसे पहले, mitochondria digitonin का उपयोग कर कोशिकाओं से निकाले जाते हैं, तो lauryl maltoside का उपयोग कर, बरकरार OXPHOS परिसरों mitochondrial झिल्ली से अलग कर रहे हैं. OXPHOS परिसरों तो ढाल जेल ट्रो द्वारा नकारात्मक चार्ज डाई, Coomassie नीले रंग की उपस्थिति में हल कर रहे हैं, जो प्रोटीन एकत्रीकरण रोकता है और कैथोड के प्रति प्रोटीन परिसरों की electrophoretic गतिशीलता सुनिश्चित करता है । अंत में, मानक immunoblotting द्वारा OXPHOS परिसरों का पता लगाया जाता है । इस प्रकार, बीएन-पृष्ठ एक सुविधाजनक और सस्ती तकनीक है कि पूरे OXPHOS परिसरों के विधानसभा का मूल्यांकन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, बुनियादी एसडीएस के विपरीत-पृष्ठ केवल व्यक्तिगत OXPHOS परिसर उपइकाईयों के अध्ययन की अनुमति ।
Mitochondria ऊर्जा उत्पादन, सेलुलर चयापचय, सिग्नलिंग, apoptosis, एजिंग, आदि1,2,3के विनियमन में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाने के लिए बहुआयामी organelles हैं । mitochondria में ऊर्जा उत्पादन ऑक्सीडेटिव फास्फारिलीकरण समारोह है कि एटीपी संश्लेषण के साथ जोड़े श्वसन पर निर्भर करता है । मानव कोशिकाओं में, mitochondrial ऑक्सीडेटिव फास्फारिलीकरण प्रणाली (OXPHOS) पांच परिसरों से बना है । परिसरों मैं-IV mitochondrial झिल्ली अंतरिक्ष में एक विद्युत प्रोटॉन ढाल बना है कि परिसर वी द्वारा प्रयोग किया जाता है एटीपी का उत्पादन । प्रत्येक OXPHOS परिसर multimeric है और, जटिल द्वितीय को छोड़कर, दोनों परमाणु और mitochondrial जीन द्वारा इनकोडिंग उपइकाईयों से बना है । उत्परिवर्तनों या पर्यावरणीय तनाव के कारण OXPHOS परिसरों के मुख्य घटकों में कोई भी दोष विधानसभा और ऑक्सीडेटिव फास्फारिलीकरण प्रणाली की कार्यक्षमता को perturb कर सकता है । इसके अलावा, कार्यात्मक OXPHOS परिसरों की उचित विधानसभा विधानसभा कारकों की एक बड़ी संख्या4,5,6की आवश्यकता है ।
ब्लू नेटिव polyacrylamide जेल ट्रो (बीएन-पृष्ठ) एक मौलिक बरकरार प्रोटीन परिसरों के विश्लेषण को सक्षम करने तकनीक है और OXPHOS परिसरों के विधानसभा का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । सबसे पहले, mitochondria कोशिकाओं से digitonin, जो एक हल्के डिटर्जेंट कि कोशिकाओं की प्लाज्मा झिल्ली permeabilizes है द्वारा अलग कर रहे हैं । फिर, lauryl maltoside का उपयोग करके, OXPHOS परिसरों mitochondrial झिल्ली से जारी कर रहे हैं । ढाल जेल ट्रो का उपयोग करके, OXPHOS परिसरों उनके द्रव्यमान के अनुसार अलग कर रहे हैं । Coomassie ब्लू जी-२५० (नहीं आर २५०) नमूना बफर और नीले कैथोड बफर dissociates डिटर्जेंट-labile संघों को जोड़ा गया है लेकिन व्यक्तिगत श्वसन चेन परिसरों बरकरार रखता है8। ट्रो के दौरान, नीले कैथोड रंग युक्त बफर डाई, जो PVDF झिल्ली8के लिए OXPHOS परिसरों के कुशल हस्तांतरण सुनिश्चित करता है बिना कैथोड बफर द्वारा प्रतिस्थापित किया जाता है । OXPHOS परिसरों कल्पना करने के लिए, PVDF झिल्ली क्रमिक रूप से पांच OXPHOS परिसरों के चयनित उपइकाईयों के लिए इसी एंटीबॉडी के साथ मशीन है ।
विधि कुछ संशोधनों के साथ यहां वर्णित किसी भी संस्कृति कोशिकाओं को लागू किया जा सकता है । इसके अलावा, इस विधि OXPHOS परिसरों ऊतक नमूने9से अलग mitochondria में विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । बीएन-पेज प्रति रन प्रत्येक नमूने के लिए कम से 5-10 µ g of mitochondria की आवश्यकता है । यहाँ वर्णित विधि का उपयोग करते हुए ५००,००० प्रसंस्कृत कोशिकाओं जैसे HEK293, श-SY5Y या 143B कोशिकाओं के लगभग १० µ ग्राम mitochondria की उपज ले सकते हैं. हालांकि, बीएन विश्लेषण के लिए कक्षों की पर्याप्त मात्रा विशिष्ट कक्ष प्रकार पर निर्भर करती है ।
mitochondrial OXPHOS प्रोटीन्स का अध्ययन करने का सबसे सामान्य तरीका एसडीएस-पेज और वेस्टर्न सोख्ता है । हालांकि, एसडीएस-पृष्ठ केवल व्यक्तिगत OXPHOS उपइकाई का अध्ययन करने की अनुमति देता है और बीएन के विपरीत पृष्ठ, पूरे OXPHOS परिसरों के विधानसभा का मूल्यांकन करने के लिए इस्तेमाल नहीं किया जा सकता. स्पष्ट देशी पृष्ठ नकारात्मक आरोप डाई की उपस्थिति के बिना देशी स्थितियों में प्रोटीन परिसरों अलग और बीएन-पृष्ठ की तुलना में एक काफी कम संकल्प किया है. हालांकि, स्पष्ट देशी-पृष्ठ बीएन-पृष्ठ की तुलना में मामूली है तो यह ऐसे OXPHOS supercomplexes के रूप में प्रोटीन परिसरों के labile supramolecular सभाओं को बनाए रखने कर सकते हैं कि बीएन के तहत असंबद्ध-पृष्ठ की स्थिति10. इस प्रोटोकॉल में, ढाल जेल परिसरों अलग करने के लिए प्रयोग किया जाता है; हालांकि, वैकल्पिक रूप से, गैर-ग्रेडिएंट पृथक्करण उपयोग किया जा सकता यदि अपेक्षाकृत महंगा ग्रेडिएंट निर्माता11उपलब्ध नहीं है ।
महत्वपूर्ण, विधि यहां वर्णित OXPHOS परिसरों के विधानसभा का विश्लेषण करने की अनुमति देता है, जबकि परिसरों की कार्यक्षमता का आकलन नहीं है । एक उच्च संकल्प बी एन-जेल गतिविधि परख11 के रूप में के रूप में अच्छी तरह से mitochondrial परिसर12 के स्पेक्ट्रोफोटोमेट्रिक एंजाइमी गतिविधि परख के बाद पृष्ठ OXPHOS परिसरों के कार्यात्मक विश्लेषण के लिए कुशल तकनीक हैं । हालांकि, इन दोनों तरीकों के OXPHOS परिसरों की विधानसभा परख नहीं है ।
इस प्रकार, बीएन-पृष्ठ अलग OXPHOS परिसरों के विधानसभा की जांच करने के लिए इष्टतम विधि है । उदाहरण के लिए, कुछ mitochondrial विकारों, जैसे लेबर वंशानुगत ऑप्टिक न्यूरोपैथी (LHON), mitochondrial encephalopathy के साथ लैक्टिक दाखवते और स्ट्रोक जैसे एपिसोड (मेला), OXPHOS के एक या एक से अधिक घटकों के बदल विधानसभा के साथ जुड़े रहे हैं सिस्टम5. यहाँ वर्णित बीएन-पृष्ठ पद्धति का उपयोग करके mitochondrial रोगों के आणविक तंत्र का अध्ययन किया जा सकता है.
प्रोटोकॉल का सबसे महत्वपूर्ण भागों में से एक नमूना तैयारी, भंडारण और जेल ट्रो के दौरान बरकरार OXPHOS परिसरों को संरक्षित करने के लिए है । इस प्रकार, mitochondria + 4 डिग्री सेल्सियस पर पृथक किया जाना चाहिए और नमूनों फ्रीज गल चक्र से गुजरना नहीं करना चाहिए । OXPHOS परिसरों केवल पूरी प्रक्रिया के दौरान एक फ्रीज-गल चक्र बर्दाश्त कर सकते हैं । एकाधिक फ्रीज-गल चक्र OXPHOS परिसरों को नष्ट (आंकड़ा 1b) । नियंत्रण और प्रयोगात्मक नमूनों की तुलना में कर रहे हैं कि समानांतर में तैयार किया जाना चाहिए भंडारण की स्थिति में किसी भी मतभेद है, जो भ्रामक परिणाम दे सकता है से बचने के लिए. यदि यह सभी नमूनों के साथ समानांतर में प्रोटोकॉल के सभी चरणों का प्रदर्शन करने के लिए संभव नहीं है, हम-८० डिग्री सेल्सियस (इस प्रोटोकॉल में १.४ कदम) पर धोया सेल छर्रों फ्रीज करने के लिए अनुशंसा करते हैं और बाद में सभी नमूनों के लिए प्रोटोकॉल के बाकी एक साथ बाहर ले कम से जेल elec तक trophoresis । ट्रो तंत्र (टैंक, कैसेट) की सफाई के लिए विशेष ध्यान दिया जाना चाहिए । यदि एक ही उपकरण एसडीएस के लिए प्रयोग किया जाता है-पृष्ठ, यह बहुत अच्छी तरह से धोने से पहले बीएन पृष्ठ । किसी भी अवशिष्ट एसडीएस ट्रो के दौरान OXPHOS परिसरों के पृथक्करण पैदा कर सकता है ।
उच्च गुणवत्ता ढाल जैल प्रोटोकॉल का एक और महत्वपूर्ण हिस्सा हैं । नीले देशी पृष्ठ के लिए कास्टिक जैल व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं; हालांकि, यह उन का उपयोग करने के लिए अनुशंसित नहीं है, क्योंकि वाणिज्यिक जैल के लिए उपयोग किए गए बफ़र्स नमूना बफ़र्स से भिन्न है जो किसी संरचना, हो सकता है । यहां इस्तेमाल किया जेल के ढाल (6-15%) व्यक्तिगत OXPHOS परिसरों की जुदाई के लिए इष्टतम है । उच्च क्रम supramolecular संरचनाओं का पता लगाने के लिए OXPHOS, भी श्वसन श्रृंखला supercomplexes14के रूप में जाना जाता है, कुछ अनुकूलन11की आवश्यकता है ।
OXPHOS परिसरों के दृश्य के लिए विशिष्ट एंटीबॉडी क्रमिक उपयोग करते हैं, उनके गुणों के आधार पर. उदाहरण के लिए, सबसे कमजोर संकेत और पिछले सबसे मजबूत संकेत के साथ एंटीबॉडी देता है कि एंटीबॉडी पहले का उपयोग करें । यह महत्वपूर्ण है के बाद से अलग करना पता लगाने (आंकड़ा 1 डी) कमजोर । श्वसन श्रृंखला परिसरों की संरचना की जांच की जा सकती है अगर बीएन के बाद-पृष्ठ जेल दूसरा आयाम एसडीएस-पृष्ठ15के अधीन है ।
प्रोटोकॉल यहां वर्णित व्यक्तिगत OXPHOS परिसरों के खिलाफ एंटीबॉडी का उपयोग क्रमिक रूप से पता चलता है । हालांकि, व्यावसायिक रूप से उपलब्ध OXPHOS एंटीबॉडी कॉकटेल का उपयोग सभी पांच OXPHOS परिसरों का एक साथ पता लगाने के लिए किया जा सकता है । फिर भी, को पूरी तरह से इकट्ठे OXPHOS परिसरों का पता लगाने और उनकी पहचान को परिभाषित करने में सक्षम हो, व्यक्तिगत OXPHOS परिसरों के खिलाफ एंटीबॉडी क्रमिक रूप से इस्तेमाल किया जाना चाहिए । यह कदम समय लेने वाली है; हालांकि, यह नई प्रायोगिक शर्तों और मॉडलों के परीक्षण के लिए आवश्यक हो सकता है ।
mitochondrial आइसोलेशन के लिए उपयोग की गई digitonin की एकाग्रता को विशिष्ट कक्ष प्रकार के लिए ऑप्टिमाइज़ किया जाना चाहिए. एक डिटर्जेंट के रूप में, digitonin permeabilizes कोशिका झिल्ली । digitonin कुशलता के इष्टतम एकाग्रता mitochondrial झिल्ली बरकरार छोड़ने कोशिकाओं की प्लाज्मा झिल्ली permeabilizes । digitonin की बहुत कम एकाग्रता mitochondrial के अर्क के उच्च संदूषण का कारण बनता है, जबकि बहुत अधिक एकाग्रता mitochondrial झिल्ली को नुकसान पहुंचाता है और कुल mitochondrial उपज को कम करता है । इष्टतम digitonin/प्रोटीन अनुपात (जी/जी) ०.३ से 1 के लिए बदलता है । छर्रों और supernatants से निकाले गए प्रोटीन के पश्चिमी दाग विश्लेषण16digitonin के इष्टतम एकाग्रता का परीक्षण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।
इस प्रोटोकॉल immunoblot पर प्रोटीन लोड हो रहा है नियंत्रण शामिल नहीं है; इसलिए, निकाले गए परिसरों के प्रोटीन एकाग्रता सावधानी से कम से triplicates में मापा जाना चाहिए बराबर लोड हो रहा है सुनिश्चित करने के लिए । इसके अलावा, नमूने बीएन में चलाया जा सकता है-पृष्ठ में दोहराने । चयनित OXPHOS परिसरों की असेंबली ख़राब है, तो अप्रभावित परिसरों नियंत्रण लोड हो रहा है के रूप में सेवा कर सकते हैं ।
बीएन-पेज में प्रोटीन कॉम्प्लेक्स के आणविक द्रव्यमान का आकलन18को चुनौती दे रहा है । वर्तमान प्रोटोकॉल आणविक भार मार्कर शामिल नहीं है; इसलिए, असेंबली का अनुमान लगाने के लिए OXPHOS परिसरों, अप्रभावित परिसरों वाले नियंत्रण नमूने हमेशा विश्लेषण में शामिल किया जाना चाहिए । बीएन-पेज के लिए नियंत्रण नमूने आमतौर पर अनुपचारित या जंगली प्रकार की कोशिकाओं रहे हैं ।
यहां प्रस्तुत विधि mitochondrial श्वसन श्रृंखला परिसरों का पता लगाने के लिए अनुकूलित है; तथापि, यह भी mitochondrial प्रोटीन के oligomerization के मूल्यांकन के लिए लागू किया जा सकता है19। इसके अलावा, OXPHOS परिसरों की विधानसभा दर पहले घट mitochondrial-इनकोडिंग उप क्लॉरॅंफेनिकोल द्वारा परिसरों युक्त इकाई द्वारा अध्ययन किया जा सकता है और फिर क्लॉरॅंफेनिकोल10को हटाने के बाद उनकी वसूली का पालन । इस प्रकार, बीएन-पृष्ठ स्थिर मूल्यांकन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता राज्य के स्तर और मानव mitochondrial विकारों9,11के आणविक निदान सहित विभिन्न अनुप्रयोगों के लिए OXPHOS की विधानसभा.
The authors have nothing to disclose.
हेलसिंकी विश्वविद्यालय के पुस्तकालय प्रकाशन में वित्तीय सहायता के लिए धंयवाद दिया है ।
100 mm cell plates | Thermo Fisher Scientific | 130182 | |
40% Acrylamide/Bis 37.5:1 | Bio-Rad | 161-0148 | |
Aminocaproic acid | Sigma | A2504 | |
Ammonium persulfate | Sigma | A3678 | |
Anti-ATP5A | Abcam | 14748 | Complex V subunit |
Anti-MTCOI | Abcam | 14705 | Complex VI subunit |
Anti-NDUFA9 | Abcam | 14713 | Complex I subunit |
Anti-SDHA | Abcam | 14715 | Complex II subunit |
Anti-UQCRC2 | Abcam | 14745 | Complex III subunit |
Bis-tris | Sigma | B7535 | |
Bradford protein assay kit | BioRad | 5000006 | |
Cell scrapers | Fisher | 11597692 | |
Coomassie blue G250 (Serva Blue G) | Serva | 35050 | |
Digitonin | Sigma | D141 | |
DMEM | Lonza | 12-614F/12 | |
EDTA | Life Technologies | 15575-038 | |
FBS | Life Technologies | 10270106 | |
Fetal bovine serum | Life Technologies | 10270106 | |
Glycerol | (Sigma | G5516 | |
Gradient maker | Bio-Rad | 1654120 | |
Lauryl maltoside (n-Dodecyl β-D-maltoside) | Sigma | D4641 | |
L-glutamine | Life Technologies | 25030024 | |
L-glutamine | Gibco | 25030 | |
N,N,N′,N′-Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Sigma | T9281 | |
PBS | Life Technologies | BE17-516F | |
Penicillin/Streptomycin | Lonza | 17-602E | |
Penicillin/streptomycin | Gibco | 15140 | |
Power supply | GE Healthcare | EPS 301 | |
Protease inhibitors | Thermo Scientific | 10137963 | |
Trans-blot turbo mini PVDF | BioRad | 1704156 | |
Tricine | Sigma | T9784 | |
Trypsin-EDTA | Gibco | 15400054 | |
Vertical electrophoresis apparatus | BioRad | 1658004 |