Модель администрирования Galleria mellonella устные Innate иммунных реакций Study Commensal-Induced
Summary
Здесь мы предоставляем подробный протокол для орального применения модели с использованием Galleria mellonella личинок и как охарактеризовать индуцированной innate иммунных реакций. Используя этот протокол, исследователи без практический опыт будет иметь возможность использовать G. mellonella кормление метод.
Abstract
Исследование иммуногенных потенциал синантропных бактерий на хост иммунной системы является одним из главных компонентов при изучении кишечных хост микробных взаимодействий. Хорошо известно, что различные Комменсалами exhibit различные потенциал для стимулирования кишечной иммунной системы хоста. Такие расследования связаны позвоночных животных, особенно грызунов. Поскольку все этические проблемы связаны с экспериментами с участием позвоночных, существует высокий спрос на беспозвоночных замены моделей.
Здесь мы предоставляем Galleria mellonella орального применения модели с помощью синантропных непатогенные бактерии и возможной оценки иммуногенность потенциал Комменсалами на G. mellonella иммунной системы. Мы демонстрируем, что G. mellonella является полезным альтернативная замена беспозвоночных модель, которая позволяет анализ Комменсалами с различными иммуногенность потенциал как бактериальный vulgatus и Escherichia coli. Интересно, что бактерии выставлены не убийство влияет на личинки, который похож на млекопитающих. Иммунные реакции G. mellonella были сопоставимы с позвоночных innate иммунных реакций и предусматривать признание бактерий и производства антимикробных молекул. Мы предлагаем, что G. mellonella удалось восстановить предыдущий баланс микробиоты, которая хорошо известна из здоровых людей у млекопитающих. Хотя предоставление сопоставимых innate иммунных реакций в G. mellonella и позвоночных, G. mellonella не гавань адаптивной иммунной системы. Так как исследованы компоненты иммунной системы эволюционной сохраняется, модель позволяет биографии и первый анализ бактериальных иммуногенных свойств.
Introduction
Кишечная микрофлора является важным компонентом для поддержания гомеостаза и включает как врожденного и адаптивного иммунного ответа1,2. Синантропных микробиоты сообщество характеризуется различными основными составляющими синантропных: симбионтами, которые наделяют благотворное влияние важных иммуномодулирующих функций, и pathobionts, что может иметь пагубные последствия генетически предрасположены размещает и поощрения и вызвать кишечные воспаления3,4. Многие исследования симбионтами и pathobionts и их влияние на хост иммунной системы были опубликованы главным образом изучение адаптивного иммунного ответа.
Поскольку эти исследования включают много животных для расследования и защиты и замены животных, используемых для экспериментов повышения общественного интереса, мы стремимся найти замену модель позволяет для скрининга различных бактериальных иммуногенность Свойства. Насекомые, особенно Galleria mellonella, являются широко используется замена модели в исследованиях инфекции. G. mellonella сочетает в себе различные преимущества, такие как низкая стоимость и высокая пропускная способность; Это позволяет перорального введения бактерий, которая является естественной подверженности валютному риску маршрут, и он позволяет системной инфекции5,6. G. mellonella далее позволяет инкубации при 37 ° C, который является температура физиологических тела млекопитающих и оптимальной для бактериальных вирулентности фактор выражение5. Основным преимуществом G. mellonella является сохраняемой врожденной иммунной системы, которая позволяет дискриминацию себя от несамоуправляющихся и кодирует различных рецепторов шаблон признание как apolipophorin или опсонин hemolin6, 7. после признания микроба, G. mellonella может вызвать различные течению гуморального иммунного ответа. Это может вызвать реакции окислительного стресса и выделяют реактивнооксигенных видов (ров), который включает в себя деятельность нос (азотная оксидазы синтетазы) и NOX (NADPH оксидаза)6,8. Кроме того, G. mellonella активирует ответ мощным антимикробные пептид (AMP), что приводит к секреции смесь различных усилителей, например gloverin, moricin, цекропин или дефенсина как gallerimycin6, 8,9,10. Как правило усилители имеют довольно широкий принимающей специфику против грамположительных и грамотрицательных бактерий и грибков и должны предоставить мощный ответ, поскольку насекомых хватает каких-либо адаптивный ответ10. Gloverin является AMP, активен против бактерий и грибков и тормозит формирование внешней мембраны6,11. Moricins выставку их антимикробной функция против грамположительных и грамотрицательных бактерий, проникая мембраны и формировании порового9,11. Cecropins обеспечивают деятельность против бактерий и грибков и разрушения мембраны аналогично как moricins9,10. Gallerimycin – это пептид дефенсина как с противогрибковыми свойствами9. Интересно, что было установлено, что сочетание цекропин и gallerimycin имеют синергетический активность против E. coli10.
Из-за их легкой в использовании символов G. mellonella личинки являются инфекции часто используется модель для оценки бактериальных патогенности. В частности исследования, в которых данные, полученные из G. mellonella коррелируют с данными, полученными от мышей поддержки сила этой модели альтернативного размещения. Было установлено, что наиболее патогенных серотипов Listeria моноцитогенес в мышиной модели инфекции приведет также к более высокой смертности в G. mellonella после системной инфекции. Кроме того менее вирулентные серотипов оказался также менее вирулентные в G. mellonella модель12. Аналогичные замечания были сделаны с человека патогенных грибов Candida albicans. Вирулентность из различных C. albicans штаммов была проведена системной инфекции и последующий мониторинг личиночной выживания. Мышь avirulent штаммы были также avirulent или выставлены снижение вирулентности в G. mellonella, в то время как мыши вирулентных штаммов приведет также к высокой смертности личиночной13. G. mellonella модель может далее использоваться для идентификации типа 3 секрецию системы факторов патогенности Pseudomonas aeruginosa14.
Поскольку большинство расследований с участием G. mellonella были сосредоточены на факторы вирулентности, используя подход системной инфекции мы были особенно заинтересованы в предоставлении метода для анализа кишечных Комменсалами в устной кормление модель, в которой мы можем применить собственный дозировка бактерий на личинки и не только наблюдать личиночной смертности но анализировать различные клейма innate иммунных реакций для поддержания гомеостаза кишечника.
Наш метод помогает увеличить использование G. mellonella как замена модели, так как мы сочетаем применение бактерий и анализ выражения RNA. Это не только полезно для укрепления смысл исследования бактериальной патогенеза, когда включая анализ иммунных реакций после перорального и не только наблюдение за смертности после системной инфекции. Наши методы позволяет для анализа иммуногенные свойства бактериальных непатогенные Комменсалами, поскольку это обеспечивает более сложные условия, чем культуры клеток, предлагая кишечный барьер в живом организме.
Protocol
Representative Results
Discussion
G. mellonella модель является моделью часто используется для оценки факторов вирулентности бактерий в системной инфекции подход21. Поскольку многие патогенные микроорганизмы и бактерии попадают принимающей страны через пероральном колонизации или инфекции, новые идеи до?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа финансировалась DFG (SPP1656), группе подготовки исследования DFG 1708, Bundesministerium und für Bildung Тюрингия (BMBF) и немецкий центр для исследований инфекции (DZIF).
Materials
| 1.5 mL tubes | Eppendorf | 0030120086 | |
| 100 bp DNA ladder | Thermo Fisher Scientific | 15628019 | |
| 1-Bromo-3-Chloropropane (BCP) | Sigma-Aldrich | B9673 | |
| 2 mL tubes | Eppendorf | 0030120094 | |
| 2x Mangomix | Bioline | BIO-25033 | Colony PCR |
| 50 mL tubes | Greiner Bio-One | 210 261 | |
| Agarose | Biozym | 840004 | |
| Beeswax | Mixed-Store.de | - | |
| Brain heart infusion broth | Thermo Fisher Scientific | CM1135 | |
| CloneJET PCR Cloning Kit | Thermo Fisher Scientific | K1232 | Cloning vector for 16S fragments |
| Corn grits | Ostermühle Naturkost GmbH | 306 | Organic cultivation |
| Difco LB Agar, Miller (Luria-Bertani) | Becton Dickinson | BD | |
| Difoco LB Broth, Miller (Luria-Bertani) | Becton Dickinson | 244610 | |
| DNA-free DNA Removal Kit | Thermo Fisher Scientific | 244510 | Dnase digestion |
| Dried yeast | Rapunzel | - | Organic cultivation |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (DPBS) | Thermo Fisher Scientific | 14040 | |
| Ethanol | VWR | 20821.330 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | W252506 | |
| Honey | Ostermühle Naturkost GmbH | 487 | |
| Isopropanol | VWR | 20842.330 | |
| Lightcycler 480 Instrument II | Roche Molecular Systems | 5015278001 | |
| LightCycler 480 Multiwell Plate 96, white | Roche Molecular Systems | 4729692001 | |
| Manual Microsyringe Pump with Digital Display | World Precision Instruments | DMP | |
| Micro-Fine+ U-100 insulin syringe 0.3 x 8 mm | Becton Dickinson | 324826 | Oral administration |
| Mortar, unglazed | VWR | 410-9327 | |
| Nanodrop | Thermo Fisher Scientific | 13-400-518 | |
| Nuclease-free water | Thermo Fisher Scientific | 10977035 | |
| Oxoid AnaeroGen sachets | Thermo Fisher Scientific | AN0025A | Quality and quantity of RNA |
| PCR stripes | Biozym | 710970 | |
| Pestle, unglazed grinding surface | VWR | 410-9324 | |
| Phusion proof-reading enzyme | Thermo Fisher Scientific | F553S | |
| Primers | Biomers | - | |
| PureYield Plasmid Miniprep System | Promega | A1222 | |
| QuantiFast SYBR Green PCR kit | Qiagen | 204056 | qPCR for bacterial copy number measurment |
| QuantiFast SYBR Green RT-PCR Kit | Qiagen | 204156 | qRT-PCR for gene expression measurements |
| QuantiTect Reverse Transcription Kit | Qiagen | 205311 | cDNA synthesis |
| Qubit Assay Tubes | Thermo Fisher Scientific | Q32856 | |
| Qubit dsHS DNA kit | Thermo Fisher Scientific | Q32851 | Quantification of plasmid and cDNA samples |
| Qubit fluorometer | Thermo Fisher Scientific | Q33226 | Quantification of plasmid and cDNA samples |
| RNase-ExitusPlus | AppliChem | A7153 | |
| Rnasin Ribonuclease Inhibitor | Promega | N2511 | |
| Skimmed milk powder | Sucofin | - | |
| SYBR safe DNA Gel Stain | Thermo Fisher Scientific | S33102 | |
| TRI reagent | Sigma-Aldrich | T9424 | |
| Weighing boat | VWR | 10803-148 | |
| Wheat meal | Ostermühle Naturkost GmbH | 6462 | Organic cultivation |
Riferimenti
- Nell, S., Suerbaum, S., Josenhans, C. The impact of the microbiota on the pathogenesis of IBD: lessons from mouse infection models. Nature Reviews Microbiology. 8 (8), 564-577 (2010).
- Muniz, L. R., Knosp, C., Yeretssian, G. Intestinal antimicrobial peptides during homeostasis, infection, and disease. Frontiers in Immunology. 3, 310 (2012).
- Ivanov, I. I., Honda, K. Intestinal commensal microbes as immune modulators. Cell Host Microbe. 12 (4), 496-508 (2012).
- Ayres, J. S. Inflammasome-microbiota interplay in host physiologies. Cell Host Microbe. 14 (5), 491-497 (2013).
- Champion, O. L., Titball, R. W., Bates, S. Standardization of G. mellonella Larvae to Provide Reliable and Reproducible Results in the Study of Fungal Pathogens. Journal of Fungi (Basel). 4 (3), (2018).
- Wojda, I. Immunity of the greater wax moth Galleria mellonella. Insect Science. , (2016).
- Buchmann, K. Evolution of Innate Immunity: Clues from Invertebrates via Fish to Mammals. Frontiers in Immunology. 5, 459 (2014).
- Lange, A., et al. Galleria mellonella: A Novel Invertebrate Model to Distinguish Intestinal Symbionts From Pathobionts. Frontiers in Immunology. 9 (2114), (2018).
- Tsai, C. J., Loh, J. M., Proft, T. Galleria mellonella infection models for the study of bacterial diseases and for antimicrobial drug testing. Virulence. , 1-16 (2016).
- Bolouri Moghaddam, M. R., et al. The potential of the Galleria mellonella innate immune system is maximized by the co-presentation of diverse antimicrobial peptides. Biological Chemistry. 397 (9), 939-945 (2016).
- Casanova-Torres, A. M., Goodrich-Blair, H. Immune Signaling and Antimicrobial Peptide Expression in Lepidoptera. Insects. 4 (3), 320-338 (2013).
- Mukherjee, K., et al. Galleria mellonella as a model system for studying Listeria pathogenesis. Applied and Environmental Microbiology. 76 (1), 310-317 (2010).
- Brennan, M., Thomas, D. Y., Whiteway, M., Kavanagh, K. Correlation between virulence of Candida albicans mutants in mice and Galleria mellonella larvae. FEMS Immunological and Medical Microbiology. 34 (2), 153-157 (2002).
- Miyata, S., Casey, M., Frank, D. W., Ausubel, F. M., Drenkard, E. Use of the Galleria mellonella caterpillar as a model host to study the role of the type III secretion system in Pseudomonas aeruginosa pathogenesis. Infection and Immunity. 71 (5), 2404-2413 (2003).
- Waidmann, M., et al. Bacteroides vulgatus protects against Escherichia coli-induced colitis in gnotobiotic interleukin-2-deficient mice. Gastroenterology. 125 (1), 162-177 (2003).
- Lange, A., et al. Extensive Mobilome-Driven Genome Diversification in Mouse Gut-Associated Bacteroides vulgatus mpk. Genome Biology and Evolution. 8 (4), 1197-1207 (2016).
- Hermann-Bank, M. L., Skovgaard, K., Stockmarr, A., Larsen, N., Molbak, L. The Gut Microbiotassay: a high-throughput qPCR approach combinable with next generation sequencing to study gut microbial diversity. BMC Genomics. 14, 788 (2013).
- Sato, K., et al. OmpA variants affecting the adherence of ulcerative colitis-derived Bacteroides vulgatus. Journal of Medical and Dental Science. 57 (1), 55-64 (2010).
- Freitak, D., et al. The maternal transfer of bacteria can mediate trans-generational immune priming in insects. Virulence. 5 (4), 547-554 (2014).
- Pfaffl, M. W. A new mathematical model for relative quantification in real-time RT-PCR. Nucleic Acids Research. 29 (9), 45 (2001).
- Ramarao, N., Nielsen-Leroux, C., Lereclus, D. The insect Galleria mellonella as a powerful infection model to investigate bacterial pathogenesis. Journal of Visualized Experiments. (70), e4392 (2012).
- Ramarao, N., Nielsen-Leroux, C., Lereclus, D. The insect Galleria mellonella as a powerful infection model to investigate bacterial pathogenesis. Journal of Visualized Experiments. (70), e4392 (2012).
