Un modèle d’Administration orale à des réponses immunitaires innées Study Commensal-Induced Galleria mellonella
Summary
Ici, nous fournissons un protocole détaillé pour un modèle d’administration par voie orale à l’aide de larves de Galleria mellonella et comment caractériser induit des réponses immunitaires innées. Utilisant ce protocole, les chercheurs sans expérience pratique seront en mesure d’utiliser le g. mellonella méthode de gavage.
Abstract
L’étude du potentiel immunogène de bactéries commensales sur le système immunitaire est un des éléments essentiels lors de l’étude des interactions hôtes-microorganismes intestinaux. Il est bien établi que les commensaux différents présentent un potentiel différent pour stimuler le système immunitaire intestinal. Ces enquêtes impliquant des animaux vertébrés, en particulier les rongeurs. Étant donné les préoccupations croissantes en matière d’éthique sont liés à des expériences portant sur des vertébrés, il y a une forte demande pour les modèles de remplacements d’invertébrés.
Ici, nous fournissons un modèle d’administration par voie orale de Galleria mellonella utilisant des bactéries non pathogènes commensaux et l’évaluation possible du potentiel immunogène des commensaux sur le système immunitaire de g. mellonella . Nous démontrons que g. mellonella est un modèle de remplacement d’invertébrés alternative utile qui permet l’analyse des commensaux avec potentiel immunogène différent comme Bacteroides vulgatus et Escherichia coli. Fait intéressant, les bactéries ont montré aucun effet de tuer les larves, qui est similaire aux mammifères. Les réponses immunitaires de g. mellonella étaient comparables aux vertébrés les réponses immunitaires innées et impliquent la reconnaissance de la bactérie et la production de molécules antimicrobiennes. Nous proposons que g. mellonella a réussi à rétablir l’équilibre précédent microbiote, bien connue des individus sains de mammifères. Bien que fournissant comparables les réponses immunitaires innées chez g. mellonella et de vertébrés, g. mellonella n’héberge pas un système immunitaire adaptatif. Puisque les composantes étudiées du système immunitaire inné sont évolutifs conservée, le modèle permet une présélection et première analyse des propriétés immunogènes bactériennes.
Introduction
Le microbiome intestinal est une composante essentielle pour le maintien de l’homéostasie et implique les deux réponses immunitaires innée et adaptative1,2. La communauté microbiote commensal est caractérisée par différents principaux constituants commensaux : symbiotes qui confèrent des effets bénéfiques par les fonctions immunomodulatrices important et pathobionts qui peuvent avoir des effets préjudiciables dans génétiquement prédisposé héberge et de promouvoir et de déclencher l’inflammation intestinale3,4. De nombreuses études sur les symbiotes et les pathobionts et leur influence sur le système immunitaire ont été publiés principalement étudier des réponses immunes adaptatives.
Puisque ces études impliquent beaucoup d’animaux pour les enquêtes et la protection et remplacement des animaux utilisés pour l’expérimentation est d’accroître l’intérêt du public, nous cherchons à trouver un modèle de remplacement afin de permettre un dépistage de bactéries différentes immunogènes propriétés. Insectes, en particulier la Galleria mellonella, sont un modèle de remplacement largement utilisé dans la recherche de l’infection. G. mellonella combine différents avantages tels que le faible coût et haut débit ; Il permet l’administration orale de bactéries, qui est la voie d’exposition naturelle, et qu’il permet l’infection systémique5,6. G. mellonella plus permet d’incubation à 37 ° C, qui est la température physiologique du corps des mammifères et l’optimum pour la virulence bactérienne facteur expression5. Le principal avantage de g. mellonella est le système immunitaire inné conservé qui permet la discrimination du soi du non-soi et code pour une variété de récepteurs de reconnaissance de modèle comme apolipophorine ou les opsonines hemolin6, 7. dès la reconnaissance de microbe, g. mellonella peut déclencher différents immunité humorale en aval. Il peut induire des réponses de stress oxydatif et sécrètent des espèces réactives de l’oxygène (ROS) qui implique l’activité de NOS (synthase nitrique oxydase) et NOX (NADPH oxydase)6,8. En outre, g. mellonella active une réponse puissant peptide antimicrobien (AMP), qui se traduit par la sécrétion d’un mélange d’amplis différents tels que gloverin, moricin, cécropine ou le gallerimycin de type defensin6, 8,9,10. En règle générale, amplis ont une spécificité très large spectre d’hôtes contre les champignons et les bactéries gram-positives et Gram-négatives et doivent fournir une réponse puissante étant donné que les insectes ne manquent aucune réponse adaptative10. Gloverin est un amplificateur actif contre les bactéries et les champignons et inhibe la formation de la membrane externe6,11. Moricins pièce leur fonction antimicrobienne contre les bactéries gram-positives et Gram-négatives de pénétrer la membrane et formant un pore9,11. Objectif fournit une activité contre les bactéries et les champignons et permeabilize la membrane de la même manière comme moricins9,10. Gallerimycin est un peptide de type defensin avec propriétés anti-fongiques9. Fait intéressant, il a été constaté que la combinaison de cécropine et gallerimycin avait une activité synergique contre e. coli10.
En raison de leur caractère de facile-à-utiliser g. mellonella larves sont un modèle d’infection souvent utilisé pour évaluer la pathogénicité bactérienne. En particulier, études dans lesquels des données provenant de g. mellonella sont en corrélation avec les données obtenues du support de la souris, la force de ce modèle d’hôte alternatif. Il a été constaté que les sérotypes les plus pathogènes dans un modèle d’infection de souris de Listeria monocytogenes conduisent aussi à des taux plus élevés de mortalité dans g. mellonella après l’infection systémique. En outre, moins virulentes sérotypes avéré pour être aussi moins virulente dans le modèle de g. mellonella 12. Des observations similaires ont été faites avec les champignons pathogènes humains Candida albicans. Virulence souches différentes de c. albicans a été évaluée par infection systémique et suivi de la survie des larves. Les souches avirulentes de souris ont été également non virulente ou exposées réduit de virulence chez g. mellonella, alors que les souches virulentes de souris mènent également à forte mortalité larvaire13. Le modèle de g. mellonella pourrait également servir à identifier type 3 sécrétion système facteurs de pathogénicité de Pseudomonas aeruginosa14.
Étant donné que la plupart des enquêtes impliquant g. mellonella ont porté sur les facteurs de virulence à l’aide de l’approche de l’infection systémique nous intéressait surtout en fournissant une méthode appropriée pour l’analyse des commensaux intestinale dans un gavage oral modèle dans lequel nous pouvons appliquer un dosage distinct des bactéries par les larves et non seulement observer le taux de mortalité larvaire mais analyser les différentes caractéristiques des réponses immunitaires innées pour maintenir l’homéostasie intestinale.
Notre méthode permet d’accroître l’utilisation de g. mellonella comme un modèle de remplacement puisque nous combinons l’application de bactéries et de l’analyse de l’expression des RNA. Il n’est pas seulement utile renforcer le sens d’études de la pathogénie bactérienne quand y compris l’analyse des réponses immunitaires après administration par voie orale et non seulement l’observation des taux de mortalité après une infection systémique. Nos méthodes permet d’analyse des propriétés immunogènes de bactéries non pathogènes commensaux puisqu’il est fournit des conditions plus complexes que la culture de cellules en offrant une barrière intestinale dans un organisme vivant.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le modèle de g. mellonella est un modèle souvent utilisé pour évaluer les facteurs de virulence bactériens dans une infection systémique approche21. Puisque de nombreuses bactéries et agents pathogènes entrent l’hôte par l’intermédiaire de la colonisation ou l’infection par voie orale, nouvelles connaissances doivent être trouvées pour évaluer des g. mellonella comme un modèle de colonisation orale et l’infection.
La possibilité …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été financé par la DFG (SPP1656), le groupe de formation de recherche DFG 1708, le Bundesministerium für Bildung und Forschung (BMBF) et le centre allemand pour la recherche Infection (DZIF).
Materials
| 1.5 mL tubes | Eppendorf | 0030120086 | |
| 100 bp DNA ladder | Thermo Fisher Scientific | 15628019 | |
| 1-Bromo-3-Chloropropane (BCP) | Sigma-Aldrich | B9673 | |
| 2 mL tubes | Eppendorf | 0030120094 | |
| 2x Mangomix | Bioline | BIO-25033 | Colony PCR |
| 50 mL tubes | Greiner Bio-One | 210 261 | |
| Agarose | Biozym | 840004 | |
| Beeswax | Mixed-Store.de | - | |
| Brain heart infusion broth | Thermo Fisher Scientific | CM1135 | |
| CloneJET PCR Cloning Kit | Thermo Fisher Scientific | K1232 | Cloning vector for 16S fragments |
| Corn grits | Ostermühle Naturkost GmbH | 306 | Organic cultivation |
| Difco LB Agar, Miller (Luria-Bertani) | Becton Dickinson | BD | |
| Difoco LB Broth, Miller (Luria-Bertani) | Becton Dickinson | 244610 | |
| DNA-free DNA Removal Kit | Thermo Fisher Scientific | 244510 | Dnase digestion |
| Dried yeast | Rapunzel | - | Organic cultivation |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (DPBS) | Thermo Fisher Scientific | 14040 | |
| Ethanol | VWR | 20821.330 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | W252506 | |
| Honey | Ostermühle Naturkost GmbH | 487 | |
| Isopropanol | VWR | 20842.330 | |
| Lightcycler 480 Instrument II | Roche Molecular Systems | 5015278001 | |
| LightCycler 480 Multiwell Plate 96, white | Roche Molecular Systems | 4729692001 | |
| Manual Microsyringe Pump with Digital Display | World Precision Instruments | DMP | |
| Micro-Fine+ U-100 insulin syringe 0.3 x 8 mm | Becton Dickinson | 324826 | Oral administration |
| Mortar, unglazed | VWR | 410-9327 | |
| Nanodrop | Thermo Fisher Scientific | 13-400-518 | |
| Nuclease-free water | Thermo Fisher Scientific | 10977035 | |
| Oxoid AnaeroGen sachets | Thermo Fisher Scientific | AN0025A | Quality and quantity of RNA |
| PCR stripes | Biozym | 710970 | |
| Pestle, unglazed grinding surface | VWR | 410-9324 | |
| Phusion proof-reading enzyme | Thermo Fisher Scientific | F553S | |
| Primers | Biomers | - | |
| PureYield Plasmid Miniprep System | Promega | A1222 | |
| QuantiFast SYBR Green PCR kit | Qiagen | 204056 | qPCR for bacterial copy number measurment |
| QuantiFast SYBR Green RT-PCR Kit | Qiagen | 204156 | qRT-PCR for gene expression measurements |
| QuantiTect Reverse Transcription Kit | Qiagen | 205311 | cDNA synthesis |
| Qubit Assay Tubes | Thermo Fisher Scientific | Q32856 | |
| Qubit dsHS DNA kit | Thermo Fisher Scientific | Q32851 | Quantification of plasmid and cDNA samples |
| Qubit fluorometer | Thermo Fisher Scientific | Q33226 | Quantification of plasmid and cDNA samples |
| RNase-ExitusPlus | AppliChem | A7153 | |
| Rnasin Ribonuclease Inhibitor | Promega | N2511 | |
| Skimmed milk powder | Sucofin | - | |
| SYBR safe DNA Gel Stain | Thermo Fisher Scientific | S33102 | |
| TRI reagent | Sigma-Aldrich | T9424 | |
| Weighing boat | VWR | 10803-148 | |
| Wheat meal | Ostermühle Naturkost GmbH | 6462 | Organic cultivation |
Riferimenti
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