Ein Galleria Mellonella mündliche Administrationsmodell zu Study Commensal-Induced angeborene Immunantwort
Summary
Hier bieten wir ein detailliertes Protokoll für eine orale Verabreichung Modell mit Galleria Mellonella Larven und wie prägen angeborene Immunantwort induziert. Unter Verwendung dieses Protokolls, werden Forscher ohne praktische Erfahrung der G. Mellonella Zwangsfütterung Methode verwenden können.
Abstract
Die Untersuchung der immunogenen Potenzial der Kommensalen Bakterien auf das Immunsystem des Wirts ist ein wesentlicher Bestandteil, wenn Darm Host-Mikroben-Interaktionen zu studieren. Es ist allgemein bekannt, dass verschiedene Kommensalen ein unterschiedliches Potenzial zeigen, das intestinale Immunsystem des Wirts zu stimulieren. Diese Untersuchungen beinhalten Wirbeltiere, insbesondere Nagetiere. Da zunehmende ethische Bedenken mit Experimente mit Wirbeltieren verknüpft sind, gibt es eine hohe Nachfrage nach Wirbellosen Ersatz-Modellen.
Hier bieten wir ein Galleria Mellonella orale Verabreichung Modell mithilfe von Kommensalen nicht-pathogenen Bakterien und mögliche Einschätzung der immunogenen Potenzial der Kommensalen auf das Immunsystem G. Mellonella . Wir zeigen, dass G. Mellonella ist eine nützliche alternative Wirbellosen Ersatz-Modell, das ermöglicht die Analyse von Kommensalen mit verschiedenen immunogen Potenzial wie Bacteroides Vulgatus und Escherichia coli. Interessanterweise ausgestellt die Bakterien keine abtötende Wirkung auf die Larven, die ist ähnlich wie bei Säugetieren. Die Immunantwort von G. Mellonella waren vergleichbar mit fest gefügten angeborenen Immunantwort und Anerkennung der Bakterien und Produktion antimikrobielle Moleküle. Wir schlagen vor, dass G. Mellonella in der Lage war, frühere Mikrobiota Gleichgewicht wiederherzustellen, die aus gesunden Säugetieren bekannt ist. Obwohl vergleichbare angeborene Immunantwort in G. Mellonella und Wirbeltieren zu bieten, G. Mellonella keiner adaptiven Immunsystems Hafen. Da die untersuchten Komponenten des angeborenen Immunsystems evolutionären konserviert sind, kann das Modell eine Vorsortierung und erste Analyse der bakteriellen immunogenen Eigenschaften.
Introduction
Der Darm Microbiome ist ein wesentlicher Bestandteil zur Aufrechterhaltung der Homöostase und beinhaltet sowohl angeborene und adaptive Immunantworten1,2. Die Kommensale Mikrobiota Gemeinschaft zeichnet sich durch verschiedene Kommensale Hauptbestandteile: Symbionten, die wohltuende Wirkung von wichtigen immunmodulatorischen Funktionen und Pathobionts, auf die negativen Auswirkungen können genetisch prädisponiert zu verleihen beherbergt, zu fördern und auslösen Darmentzündung3,4. Viele Studien über Symbionten und Pathobionts und deren Einfluss auf das Immunsystem des Wirts wurden vor allem studieren adaptive Immunantworten veröffentlicht.
Da diese Studien viele Tiere für die Untersuchungen und den Schutz beinhalten und Ersatz der Versuchstiere für Experimente ist öffentliches Interesse zu erhöhen, versuchen wir, ein Ersatz-Modell ermöglicht eine Vorführung der verschiedenen bakteriellen immunogen zu finden Eigenschaften. Insekten, vor allem Galleria Mellonella, sind eine weit verbreitete Ersatz-Modell in der Infektionsforschung. G. Mellonella vereint verschiedene Vorteile wie niedrige Kosten und hohen Durchsatz; Es ermöglicht oralen Verabreichung von Bakterien, der die natürliche Expositionsweg, und für systemische Infektion5,6. G. Mellonella weiter ermöglicht Inkubation bei 37 ° C, was die physiologischen Körpertemperatur der Säugetiere und das Optimum für bakterielle Virulenz Faktor Ausdruck5ist. Der Hauptvorteil von G. Mellonella ist das erhaltene angeborene Immunsystem, das ermöglicht der Diskriminierung des selbst von nicht-selbst und kodiert eine Vielzahl von Muster-Erkennung-Rezeptoren wie Apolipophorin oder Opsonin Hemolin6, 7. auf Mikrobe Anerkennung, G. Mellonella verschiedenen nachgeschalteten humorale Immunantwort auslösen können. Es kann verursachen oxidativen Stress-Reaktionen und sezernieren reaktive Sauerstoffspezies (ROS), die die Tätigkeit der NOS (Salpetersäure Oxidase-Synthase) und NOX (NADPH Oxidase)6,8umfasst. Darüber hinaus aktiviert G. Mellonella eine potente antimikrobielle Peptide (AMP) Antwort, die Ergebnisse in der Sekretion aus einer Mischung von verschiedenen AMPs wie Gloverin, Moricin, Cecropin oder defensin-ähnliche Gallerimycin6, 8,9,10. In der Regel AMPs haben ziemlich breit Wirtsspezifität gegen grampositive und gramnegative Bakterien und Pilze und eine starke Antwort zu geben, da Insekten eine Anpassungsreaktion10fehlen. Gloverin ist ein AMP aktiv gegen Bakterien und Pilze und hemmt die Außenmembran Bildung6,11. Moricins zeigen ihre antimikrobielle Funktion gegen grampositive und gramnegative Bakterien durch die Membran durchdringen und bilden eine Pore9,11. Cecropins bieten Aktivität gegen Bakterien und Pilze und die Membran ähnlich wie Moricins9,10permeabilize. Gallerimycin ist ein defensin-Like-Peptid mit Anti-Pilz-Eigenschaften-9. Interessanterweise wurde festgestellt, dass die Kombination von Cecropin und Gallerimycin eine synergistische Wirkung gegen E. Coli10hatte.
Wegen des leicht zu bedienenden Charakters G. Mellonella sind Larven ein häufig verwendetes Infektionsmodell bakterielle Pathogenität zu beurteilen. Insbesondere korrelieren Studien in denen G. Mellonella gewonnenen Daten mit Daten aus Mäusen Unterstützung der Stärke dieses alternative Host-Modells. Es wurde festgestellt, dass die meisten pathogenen Serotypen von Listeria Monocytogenes in einem Mausmodell der Infektion auch zu einer höheren Sterblichkeit in G. Mellonella nach einer systemischen Infektion führen. Weitere, weniger virulenten Serotypen erwies sich auch weniger virulenten in G. Mellonella Modell12. Ähnliche Beobachtungen wurden mit den menschlichen Pathogene Pilze Candida Albicans. Virulenz der verschiedenen C. Albicans Stämme durch systemische Infektion und anschließende Überwachung der Larven Überleben bewertet wurde. Avirulent Mausstämme gab auch avirulent oder ausgestellten Virulenz in G. Mellonella, reduziert, während die Maus virulente Stämme auch zu hohe larval Sterblichkeit13führen. G. Mellonella Modell könnte weiter zum Typ 3 Sekretion Systemgrößen Pathogenität von Pseudomonas Aeruginosa14zu identifizieren.
Da die meisten Untersuchungen mit G. Mellonella auf Virulenzfaktoren mit dem systemischen Infektion Ansatz fokussiert waren, waren wir besonders daran interessiert, Bereitstellung einer Methode für die Analyse der intestinalen Kommensalen in einer mündlichen Zwangsfütterung geeignet Modell, in denen wir gelten unterschiedliche Dosierung von Bakterien pro Larven und beobachten nicht nur die Larven Sterblichkeit sondern analysieren verschiedene Kennzeichen der angeborenen Immunantwort zu intestinalen Homöostase.
Unsere Methode hilft, um die Verwendung von G. Mellonella als ein Ersatzmodell zu erhöhen, da wir die Anwendung von Bakterien und die Analyse der RNA Ausdruck kombinieren. Es ist nicht nur nützlich, die Bedeutung der bakterielle Pathogenese Studien zu stärken, wenn auch die Analyse von Immunreaktionen nach oraler Gabe und nicht nur die Beobachtung der Sterblichkeit nach einer systemischen Infektion. Unsere Methoden ermöglicht die Analyse der immunogenen Eigenschaften der bakteriellen apathogen Kommensale denn es bietet komplexere Bedingungen als Zellkultur, indem ein Darmbarriere in einem lebenden Organismus.
Protocol
Representative Results
Discussion
G. Mellonella -Modell ist eine häufig verwendete bakterielle Virulenzfaktoren in einer systemischen Infektion Ansatz21zu beurteilen. Da viele Krankheitserreger und Bakterien die Gastgeber über die mündlichen Kolonisation oder Infektion Route eingeben, müssen neue Erkenntnisse gefunden werden, um G. Mellonella als Modell für die mündliche Kolonisation und Infektion zu bewerten.
Die Möglichkeit, hinten G. Mellonella zwischen 15-37 ° C is…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde von der DFG (SPP1656), das DFG-Graduiertenkolleg 1708, der Bundesministeriums Für Bildung Und Forschung (BMBF) und das Deutsche Zentrum für Infektion Forschung (DZIF) finanziert.
Materials
| 1.5 mL tubes | Eppendorf | 0030120086 | |
| 100 bp DNA ladder | Thermo Fisher Scientific | 15628019 | |
| 1-Bromo-3-Chloropropane (BCP) | Sigma-Aldrich | B9673 | |
| 2 mL tubes | Eppendorf | 0030120094 | |
| 2x Mangomix | Bioline | BIO-25033 | Colony PCR |
| 50 mL tubes | Greiner Bio-One | 210 261 | |
| Agarose | Biozym | 840004 | |
| Beeswax | Mixed-Store.de | - | |
| Brain heart infusion broth | Thermo Fisher Scientific | CM1135 | |
| CloneJET PCR Cloning Kit | Thermo Fisher Scientific | K1232 | Cloning vector for 16S fragments |
| Corn grits | Ostermühle Naturkost GmbH | 306 | Organic cultivation |
| Difco LB Agar, Miller (Luria-Bertani) | Becton Dickinson | BD | |
| Difoco LB Broth, Miller (Luria-Bertani) | Becton Dickinson | 244610 | |
| DNA-free DNA Removal Kit | Thermo Fisher Scientific | 244510 | Dnase digestion |
| Dried yeast | Rapunzel | - | Organic cultivation |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (DPBS) | Thermo Fisher Scientific | 14040 | |
| Ethanol | VWR | 20821.330 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | W252506 | |
| Honey | Ostermühle Naturkost GmbH | 487 | |
| Isopropanol | VWR | 20842.330 | |
| Lightcycler 480 Instrument II | Roche Molecular Systems | 5015278001 | |
| LightCycler 480 Multiwell Plate 96, white | Roche Molecular Systems | 4729692001 | |
| Manual Microsyringe Pump with Digital Display | World Precision Instruments | DMP | |
| Micro-Fine+ U-100 insulin syringe 0.3 x 8 mm | Becton Dickinson | 324826 | Oral administration |
| Mortar, unglazed | VWR | 410-9327 | |
| Nanodrop | Thermo Fisher Scientific | 13-400-518 | |
| Nuclease-free water | Thermo Fisher Scientific | 10977035 | |
| Oxoid AnaeroGen sachets | Thermo Fisher Scientific | AN0025A | Quality and quantity of RNA |
| PCR stripes | Biozym | 710970 | |
| Pestle, unglazed grinding surface | VWR | 410-9324 | |
| Phusion proof-reading enzyme | Thermo Fisher Scientific | F553S | |
| Primers | Biomers | - | |
| PureYield Plasmid Miniprep System | Promega | A1222 | |
| QuantiFast SYBR Green PCR kit | Qiagen | 204056 | qPCR for bacterial copy number measurment |
| QuantiFast SYBR Green RT-PCR Kit | Qiagen | 204156 | qRT-PCR for gene expression measurements |
| QuantiTect Reverse Transcription Kit | Qiagen | 205311 | cDNA synthesis |
| Qubit Assay Tubes | Thermo Fisher Scientific | Q32856 | |
| Qubit dsHS DNA kit | Thermo Fisher Scientific | Q32851 | Quantification of plasmid and cDNA samples |
| Qubit fluorometer | Thermo Fisher Scientific | Q33226 | Quantification of plasmid and cDNA samples |
| RNase-ExitusPlus | AppliChem | A7153 | |
| Rnasin Ribonuclease Inhibitor | Promega | N2511 | |
| Skimmed milk powder | Sucofin | - | |
| SYBR safe DNA Gel Stain | Thermo Fisher Scientific | S33102 | |
| TRI reagent | Sigma-Aldrich | T9424 | |
| Weighing boat | VWR | 10803-148 | |
| Wheat meal | Ostermühle Naturkost GmbH | 6462 | Organic cultivation |
Riferimenti
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