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Articolo metodologico

Un modello di amministrazione orale Galleria mellonella a risposte immunitarie Innate Study Commensal-Induced

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DOI:

10.3791/59270

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21 marzo 2019

 ,  , 

In questo articolo

Sommario

Qui, forniamo un protocollo dettagliato per un modello di somministrazione orale utilizzando larve di Galleria mellonella e come caratterizzare indotto risposte immunitarie innate. Usando questo protocollo, i ricercatori senza esperienza pratica sarà in grado di utilizzare la mellonella g. alimentazione forzata di metodo.

Abstract

L'indagine del potenziale immunogenico di batteri commensali il sistema immunitario dell'ospite è una componente essenziale nello studio di interazioni ospite-microbo intestinale. È affermato che diversi commensali esibiscono un diverso potenziale per stimolare il sistema immunitario intestinale di host. Tali indagini coinvolgono animali vertebrati, soprattutto roditori. Poiché crescenti preoccupazioni etiche sono collegate con esperimenti su vertebrati, c'è una forte domanda per i modelli di sostituzioni degli invertebrati.

Qui, forniamo un modello di somministrazione orale di Galleria mellonella utilizzando batteri commensali non patogeni e la possibile valutazione del potenziale immunogenico di commensali sul sistema immunitario mellonella g. . Dimostriamo che mellonella g. è un modello di sostituzione degli invertebrati alternativa utile che permette l'analisi di commensali con differente potenziale immunogenico quali Bacteroides vulgatus ed Escherichia coli. Interessante, i batteri hanno esibito alcun effetto di uccidere le larve, che è simile a quella dei mammiferi. Le risposte immunitarie di g. mellonella erano comparabili con la risposta immune innata dei vertebrati e coinvolgere il riconoscimento dei batteri e la produzione di molecole antimicrobiche. Proponiamo che mellonella g. era in grado di ristabilire l'equilibrio di microbiota precedente, che è ben noto da individui sani dei mammiferi. Anche se fornire risposte immunitarie innate paragonabile in entrambi mellonella g. e vertebrati, g. mellonella non porto un sistema immunitario adattativo. Poiché i componenti studiati del sistema immunitario innato sono evolutivi conservato, il modello consente un'analisi di preselezione e prima del batterica proprietà immunogeniche.

Introduzione

Il microbioma intestinale è una componente essenziale per il mantenimento dell'omeostasi e coinvolge entrambi immunitaria innata e adattativa1,2. La comunità di microflora commensale è caratterizzata da diversi costituenti principali commensale: simbionti che conferiscono benefici effetti immunomodulatori importanti funzioni, e pathobionts che può avere effetti nocivi geneticamente predisposti ospita e promuovere e attivare l'infiammazione intestinale3,4. Molti studi su simbionti e pathobionts e la loro influenza sul sistema immunitario dell'ospite son....

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Protocollo

1. g. mellonella allevamento e preparazione delle larve per gli esperimenti

Nota: Il ciclo da uovo ad instar Ultima larva dura circa 5-6 settimane.

  1. Trasferire le uova deposte da lepidotteri adulti per scatole da 2 L substrato Tarma della cera (granulosità di cereale del 22%, 22% di farina di frumento, 17,5% cera d'api, 11% latte scremato in polvere, miele di 11%, 11% glicerolo, lievito essiccato di 5.5%). Eseguire l'intero allevamento a 30 ° C al buio.
  2. Trasferire 25 g di substrato contenente le larve nel substrato fresco dopo circa 1-2 settimane, quando le larve di piccole e piccolissime erano visibili. Sincroni....

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Risultati

Il modello di infezione g. mellonella emolinfa in ampiamente usato per analizzare i fattori di virulenza di una grande varietà di agenti patogeni. Maggior parte delle misure comprendono l'analisi della mortalità di larve, che è un metodo abbastanza facile. Tuttavia, questo metodo non consentono conclusioni sulle risposte immunitarie in generale e collegare i risultati delle risposte immunitarie mellonella g. con meccanismi immuni vertebrati. Il modello di somministrazion.......

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Discussione

Il modello g. mellonella è un modello frequentemente usato per valutare i fattori di virulenza batterici in un approccio di infezione sistemica21. Poiché molti patogeni e batteri immettere l'host via orale colonizzazione o infezione, nuove intuizioni devono essere trovati per valutare mellonella g. come un modello per colonizzazione orale e l'infezione.

La possibilità di posteriore g. mellonella tra 15-37 ° C è un grande vantaggio poiché model.......

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Ringraziamenti

Questo lavoro è stato finanziato dalla DFG (SPP1656), il gruppo di formazione di ricerca DFG 1708, il Bundesministerium für Bildung und Forschung (BMBF) e il centro tedesco per ricerca di infezione (DZIF).

....

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Provette da 1,5 mLEppendorf0030120086
100 bp DNA ladder Thermo Fisher Scientific 15628019
1-Bromo-3-Cloropropano (BCP)Sigma-AldrichB9673
2 provette da 2 mLEppendorf0030120094
2x MangomixBiolineBIO-25033Colony PCR
50 mL provetteGreiner Bio-One210 261
AgarosioBiozym840004
Cerad'apiMixed-Store.de-Cervello
cuore infusione brodoThermo Fisher ScientificCM1135
CloneJET PCR Kit di clonazioneThermo Fisher ScientificK1232Vettore di clonazione per frammenti 16S
Semola di maisOstermü hle Naturkost GmbH306Coltivazione biologica
Difco LB Agar, Miller (Luria-Bertani)Becton DickinsonBD
Difoco LB Brodo, Miller (Luria-Bertani)Becton Dickinson244610
Kit di rimozione del DNA senza DNA Thermo Fisher Scientific244510  Digestione Dnase
Lievito seccoRapunzel -Coltivazione biologica
Soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbecco (DPBS)Thermo Fisher Scientific14040
EtanoloVWR20821.330
GliceroloSigma-AldrichW252506
MieleOstermü hle Naturkost GmbH487
Isopropanol VWR20842.330
Lightcycler 480 Instrument IIRoche Molecular Systems5015278001
LightCycler 480 Multiwell Plate 96, biancoRoche Molecular Systems4729692001
Pompa manuale per microsiringhe con display digitaleWorld Precision Instruments
Micro-Fine+ U-100 0,3 x 8 mmBecton Dickinson324826Mortaio per somministrazione orale
, non smaltatoVWR410-9327 
NanodropThermo Fisher Scientific13-400-518
Acqua senza nucleasi Thermo Fisher Scientific10977035
bustine Oxoid AnaeroGen Thermo Fisher Scientific AN0025AQualità e quantità di strisce RNA
PCRBiozym710970
Pestello, superficie di macinazione non smaltataVWR410-9324 
Enzima di correzione bozze Phusion Thermo Fisher ScientificF553S
PrimerBiomeri -
PureYield Plasmide Miniprep SystemPromegaA1222
QuantiFast SYBR Green PCR kit Qiagen204056qPCR per la misurazione del numero di copie batteriche
Kit QuantiFast SYBR Green RT-PCR Qiagen204156qRT-PCR per misure di espressione genica
Kit di trascrizione inversa QuantiTectQiagen205311sintesi del cDNA
Qubit Provette per saggiThermo Fisher ScientificQ32856
Kit Qubit dsHS DNA Thermo Fisher ScientificQ32851Quantificazione di campioni di plasmidi e cDNA
Fluorimetro QubitThermo Fisher ScientificQ33226Quantificazione di campioni di plasmidi e cDNA
RNase-ExitusPlusAppliChemA7153
Inibitore della ribonucleasi RnasinaPromegaN2511
Latte scremato in polvereSucofin -
SYBR sicuro DNA Gel StainThermo Fisher ScientificS33102
TRI reagente Sigma-AldrichT9424
PesatriceVWR10803-148
Farina di granoOstermü hle Naturkost GmbH6462Coltivazione biologica
Siringa per insulina DMP

Riferimenti

  1. Nell, S., Suerbaum, S., Josenhans, C. The impact of the microbiota on the pathogenesis of IBD: lessons from mouse infection models. Nature Reviews Microbiology. 8 (8), 564-577 (2010).
  2. Muniz, L. R., Knosp, C., Yeretssian, G.

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Ristampe e permessi

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