Galleria mellonella muntlig administrasjonsmodell til Study Commensal-Induced medfødte immunreaksjoner
Summary
Her gir vi en detaljert protokoll for en muntlig administrasjonsmodell bruker Galleria mellonella larver og hvordan å karakterisere indusert medfødte immunreaksjoner. Bruker denne protokollen, vil forskere uten praktisk erfaring kunne bruke G. mellonella kraft-mating metoden.
Abstract
Etterforskningen av immunogenic potensialet av commensal bakterier på verten immunsystem er en viktig komponent når studere intestinal vert-mikrobe interaksjoner. Det er godt etablert at ulike commensals ha en annen potensial til å stimulere vert intestinal immunforsvaret. Dette involverer vertebrate dyr, særlig gnagere. Siden økende Etiske bekymringene er knyttet til forsøk med virveldyr, er det en høy etterspørsel etter virvelløse erstatninger modeller.
Her gir vi en Galleria mellonella peroral administrering modell med commensal ikke-patogene bakterier og mulig vurdering av immunogenic potensialet i commensals på G. mellonella immunsystemet. Vi viser at G. mellonella er et nyttig alternativ virvelløse erstatning modell for analyse av commensals med forskjellige immunogenic potensial som Bacteroides vulgatus og Escherichia coli. Interessant, utstilt bakterier ingen drap virkning på larvene, som er lik for pattedyr. Immunreaksjoner av G. mellonella var sammenlignbart med virveldyr medfødte immunreaksjoner og anerkjennelse av bakterier og produksjon av antimikrobielle molekyler. Vi foreslår at G. mellonella kunne gjenopprette forrige bakterieflora saldo, som er kjent fra friske pattedyr individer. Selv om å gi sammenlignbare medfødte immunreaksjoner både G. mellonella og virveldyr, G. mellonella ikke havn en adaptive immunsystemet. Siden de undersøkte komponentene av det medfødte immunsystemet er evolusjonære bevart, tillater modellen en kvalifisering prescreening og første analyse av bakteriell immunogenic egenskaper.
Introduction
Den intestinal microbiome er en viktig komponent for vedlikehold av homeostase, og involverer både medfødte og adaptive immunreaksjoner1,2. Commensal bakterieflora fellesskapet er preget av ulike viktigste commensal bestanddeler: symbionter som gir gunstige effekter av viktige immunmodulerende funksjoner og pathobionts som kan ha skadelige effekter i genetisk predisposed vert og fremme og utløse intestinale betennelsen3,4. Mange studier på symbionter og pathobionts og deres innflytelse på verten immunsystemet er publisert hovedsakelig studere adaptive immunreaksjoner.
Siden disse studiene involverer mange dyr for undersøkelser og beskyttelse og utskifting av dyr som brukes til eksperimentering er økende offentlig interesse, søker vi å finne en erstatning modell å tillate en screening av ulike bakteriell immunogenic egenskaper. Insekter, spesielt Galleria mellonella, er en mye brukt erstatning modell i infeksjon forskning. G. mellonella kombinerer forskjellige fordeler som lave kostnader og høy gjennomstrømning; det tillater peroral administrering av bakterier, som er naturlig eksponering ruten, og det tillater systemisk infeksjon5,6. G. mellonella videre kan inkubasjonstiden ved 37 ° C, som er fysiologisk kroppstemperaturen av pattedyr og optimal for bakteriell virulens faktor uttrykk5. Den største fordelen med G. mellonella er det bevarte medfødte immunsystemet som muliggjør diskriminering av selvtillit fra ikke-selv og koder en rekke mønster anerkjennelse reseptorer som apolipophorin eller opsonin hemolin6, 7. på mikrobe anerkjennelse, G. mellonella kan utløse ulike nedstrøms humoral immunreaksjoner. Indusere oksidativt stress svar kan og skiller reaktive oksygen arter (ROS) som innebærer NOS (nitrat oksidase syntase) og NOX (NADPH oksidase)6,8. I tillegg G. mellonella aktiverer en potent antimikrobielle peptid (AMP) respons, som resulterer i utskillelsen av en blanding av forskjellige forsterkere som gloverin, moricin, cecropin eller defensin-lignende gallerimycin6, 8,9,10. Vanligvis forsterkere har ganske bred vert spesifisitet mot Gram-positive og Gram-negative bakterier og sopp og gi et potent svar siden insekter mangler noen adaptive responsen10. Gloverin er en forsterker aktiv mot bakterier og sopp og hemmer ytre membran formasjon6,11. Moricins viser sine antimikrobielle funksjon mot Gram-positive og Gram-negative bakterier av gjennomtrengende membranen og danner en pore9,11. Cecropins gir aktivitet mot bakterier og sopp og permeabilize membranen på samme måte som moricins9,10. Gallerimycin er et defensin som peptid med Antifungal egenskaper9. Interessant, ble det funnet at kombinasjonen av cecropin og gallerimycin hadde en samvirkningen mot E. coli10.
På grunn av deres lett-å-bruke karakter G. mellonella er Larvene en ofte brukt infeksjon modell å vurdere bakteriell virusets. Spesielt korrelerer studier i hvilke data fra G. mellonella med data fra mus støtte styrken på denne alternative vert modellen. Det ble funnet at de mest patogene serotypene av Listeria monocytogenes i en mus infeksjon modell også føre til høyere dødelighet i G. mellonella etter systemisk infeksjon. Videre mindre virulente serotyper viste seg for å være også mindre virulente i G. mellonella model12. Lignende observasjoner er gjort med den menneskelige patogene sopp Candida albicans. Virulens av ulike C. albicans stammer er vurdert av systemisk smitte og påfølgende overvåking av larver overlevelse. Mus avirulent stammer var også avirulent eller utstilt redusert virulens i G. mellonella, mens musen virulente stammene fører også til høy larver dødelighet13. G. mellonella modellen kan videre brukes til å identifisere typen 3 sekresjon systemet virusets faktorer Pseudomonas aeruginosa14.
Siden de fleste undersøkelser som involverer G. mellonella var fokusert på virulens faktorer ved hjelp av systemisk infeksjon tilnærming var vi spesielt interessert i å tilby en metode egnet for analyse av intestinal commensals i en muntlig kraft-mating modell som vi kan bruke en distinkt dosering av bakterier per larver og ikke bare observere larver dødelighet, men du kan analysere ulike kjennetegner medfødte immunreaksjoner å opprettholde intestinal homeostase.
Vår metode bidrar til å øke bruken av G. mellonella som erstatning modell siden vi kombinerer anvendelse av bakterier og analyse av RNA uttrykk. Det er ikke bare nyttig å styrke betydningen av bakteriell patogenesen studier inkludert analyse av immunreaksjoner etter peroral administrering og ikke bare observasjon av dødelighet etter systemisk infeksjon. Våre metoder kan for analyse av immunogenic egenskaper av bakteriell ikke-patogene commensals siden det gir mer komplisert forhold enn cellekultur ved å tilby en intestinal barriere i en levende organisme.
Protocol
Representative Results
Discussion
G. mellonella modellen er en brukte modell å vurdere bakteriell virulens faktorer i en systemisk infeksjon tilnærming21. Siden mange patogener og bakterier inn verten via muntlig kolonisering eller infeksjon rute, må ny innsikt finne evaluere G. mellonella som en modell for muntlig kolonisering og infeksjon.
Baksiden G. mellonella mellom 15-37 ° C er en stor fordel siden de fleste pattedyr modeller vedlikeholde kroppen temperaturer på 37 …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble finansiert av DFG (SPP1656), DFG trening forskningsgruppen 1708, Bundesministerium für Bildung und Forschung (BMBF) og tysk sentrum for infeksjon forskning (DZIF).
Materials
| 1.5 mL tubes | Eppendorf | 0030120086 | |
| 100 bp DNA ladder | Thermo Fisher Scientific | 15628019 | |
| 1-Bromo-3-Chloropropane (BCP) | Sigma-Aldrich | B9673 | |
| 2 mL tubes | Eppendorf | 0030120094 | |
| 2x Mangomix | Bioline | BIO-25033 | Colony PCR |
| 50 mL tubes | Greiner Bio-One | 210 261 | |
| Agarose | Biozym | 840004 | |
| Beeswax | Mixed-Store.de | - | |
| Brain heart infusion broth | Thermo Fisher Scientific | CM1135 | |
| CloneJET PCR Cloning Kit | Thermo Fisher Scientific | K1232 | Cloning vector for 16S fragments |
| Corn grits | Ostermühle Naturkost GmbH | 306 | Organic cultivation |
| Difco LB Agar, Miller (Luria-Bertani) | Becton Dickinson | BD | |
| Difoco LB Broth, Miller (Luria-Bertani) | Becton Dickinson | 244610 | |
| DNA-free DNA Removal Kit | Thermo Fisher Scientific | 244510 | Dnase digestion |
| Dried yeast | Rapunzel | - | Organic cultivation |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (DPBS) | Thermo Fisher Scientific | 14040 | |
| Ethanol | VWR | 20821.330 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | W252506 | |
| Honey | Ostermühle Naturkost GmbH | 487 | |
| Isopropanol | VWR | 20842.330 | |
| Lightcycler 480 Instrument II | Roche Molecular Systems | 5015278001 | |
| LightCycler 480 Multiwell Plate 96, white | Roche Molecular Systems | 4729692001 | |
| Manual Microsyringe Pump with Digital Display | World Precision Instruments | DMP | |
| Micro-Fine+ U-100 insulin syringe 0.3 x 8 mm | Becton Dickinson | 324826 | Oral administration |
| Mortar, unglazed | VWR | 410-9327 | |
| Nanodrop | Thermo Fisher Scientific | 13-400-518 | |
| Nuclease-free water | Thermo Fisher Scientific | 10977035 | |
| Oxoid AnaeroGen sachets | Thermo Fisher Scientific | AN0025A | Quality and quantity of RNA |
| PCR stripes | Biozym | 710970 | |
| Pestle, unglazed grinding surface | VWR | 410-9324 | |
| Phusion proof-reading enzyme | Thermo Fisher Scientific | F553S | |
| Primers | Biomers | - | |
| PureYield Plasmid Miniprep System | Promega | A1222 | |
| QuantiFast SYBR Green PCR kit | Qiagen | 204056 | qPCR for bacterial copy number measurment |
| QuantiFast SYBR Green RT-PCR Kit | Qiagen | 204156 | qRT-PCR for gene expression measurements |
| QuantiTect Reverse Transcription Kit | Qiagen | 205311 | cDNA synthesis |
| Qubit Assay Tubes | Thermo Fisher Scientific | Q32856 | |
| Qubit dsHS DNA kit | Thermo Fisher Scientific | Q32851 | Quantification of plasmid and cDNA samples |
| Qubit fluorometer | Thermo Fisher Scientific | Q33226 | Quantification of plasmid and cDNA samples |
| RNase-ExitusPlus | AppliChem | A7153 | |
| Rnasin Ribonuclease Inhibitor | Promega | N2511 | |
| Skimmed milk powder | Sucofin | - | |
| SYBR safe DNA Gel Stain | Thermo Fisher Scientific | S33102 | |
| TRI reagent | Sigma-Aldrich | T9424 | |
| Weighing boat | VWR | 10803-148 | |
| Wheat meal | Ostermühle Naturkost GmbH | 6462 | Organic cultivation |
Riferimenti
- Nell, S., Suerbaum, S., Josenhans, C. The impact of the microbiota on the pathogenesis of IBD: lessons from mouse infection models. Nature Reviews Microbiology. 8 (8), 564-577 (2010).
- Muniz, L. R., Knosp, C., Yeretssian, G. Intestinal antimicrobial peptides during homeostasis, infection, and disease. Frontiers in Immunology. 3, 310 (2012).
- Ivanov, I. I., Honda, K. Intestinal commensal microbes as immune modulators. Cell Host Microbe. 12 (4), 496-508 (2012).
- Ayres, J. S. Inflammasome-microbiota interplay in host physiologies. Cell Host Microbe. 14 (5), 491-497 (2013).
- Champion, O. L., Titball, R. W., Bates, S. Standardization of G. mellonella Larvae to Provide Reliable and Reproducible Results in the Study of Fungal Pathogens. Journal of Fungi (Basel). 4 (3), (2018).
- Wojda, I. Immunity of the greater wax moth Galleria mellonella. Insect Science. , (2016).
- Buchmann, K. Evolution of Innate Immunity: Clues from Invertebrates via Fish to Mammals. Frontiers in Immunology. 5, 459 (2014).
- Lange, A., et al. Galleria mellonella: A Novel Invertebrate Model to Distinguish Intestinal Symbionts From Pathobionts. Frontiers in Immunology. 9 (2114), (2018).
- Tsai, C. J., Loh, J. M., Proft, T. Galleria mellonella infection models for the study of bacterial diseases and for antimicrobial drug testing. Virulence. , 1-16 (2016).
- Bolouri Moghaddam, M. R., et al. The potential of the Galleria mellonella innate immune system is maximized by the co-presentation of diverse antimicrobial peptides. Biological Chemistry. 397 (9), 939-945 (2016).
- Casanova-Torres, A. M., Goodrich-Blair, H. Immune Signaling and Antimicrobial Peptide Expression in Lepidoptera. Insects. 4 (3), 320-338 (2013).
- Mukherjee, K., et al. Galleria mellonella as a model system for studying Listeria pathogenesis. Applied and Environmental Microbiology. 76 (1), 310-317 (2010).
- Brennan, M., Thomas, D. Y., Whiteway, M., Kavanagh, K. Correlation between virulence of Candida albicans mutants in mice and Galleria mellonella larvae. FEMS Immunological and Medical Microbiology. 34 (2), 153-157 (2002).
- Miyata, S., Casey, M., Frank, D. W., Ausubel, F. M., Drenkard, E. Use of the Galleria mellonella caterpillar as a model host to study the role of the type III secretion system in Pseudomonas aeruginosa pathogenesis. Infection and Immunity. 71 (5), 2404-2413 (2003).
- Waidmann, M., et al. Bacteroides vulgatus protects against Escherichia coli-induced colitis in gnotobiotic interleukin-2-deficient mice. Gastroenterology. 125 (1), 162-177 (2003).
- Lange, A., et al. Extensive Mobilome-Driven Genome Diversification in Mouse Gut-Associated Bacteroides vulgatus mpk. Genome Biology and Evolution. 8 (4), 1197-1207 (2016).
- Hermann-Bank, M. L., Skovgaard, K., Stockmarr, A., Larsen, N., Molbak, L. The Gut Microbiotassay: a high-throughput qPCR approach combinable with next generation sequencing to study gut microbial diversity. BMC Genomics. 14, 788 (2013).
- Sato, K., et al. OmpA variants affecting the adherence of ulcerative colitis-derived Bacteroides vulgatus. Journal of Medical and Dental Science. 57 (1), 55-64 (2010).
- Freitak, D., et al. The maternal transfer of bacteria can mediate trans-generational immune priming in insects. Virulence. 5 (4), 547-554 (2014).
- Pfaffl, M. W. A new mathematical model for relative quantification in real-time RT-PCR. Nucleic Acids Research. 29 (9), 45 (2001).
- Ramarao, N., Nielsen-Leroux, C., Lereclus, D. The insect Galleria mellonella as a powerful infection model to investigate bacterial pathogenesis. Journal of Visualized Experiments. (70), e4392 (2012).
- Ramarao, N., Nielsen-Leroux, C., Lereclus, D. The insect Galleria mellonella as a powerful infection model to investigate bacterial pathogenesis. Journal of Visualized Experiments. (70), e4392 (2012).
