Summary

نموذج المصفوفة خارج الخلية العظام ثلاثية الأبعاد ل Osteosarcoma

Published: April 12, 2019
doi:

Summary

نموذج المصفوفة خارج الخلية (BEM) العظام osteosarcoma (OS) راسخة وهو موضح هنا. يمكن استخدامه سقالة مناسبة لمحاكاة الورم الرئيسي النمو في المختبر ، وتقدم نموذجا مثاليا لدراسة تباين النسجية وفحص نظام التشغيل.

Abstract

أوستيوساركوما (نظام التشغيل) هو الأكثر شيوعاً وورم العظام الأولية شديدة عدوانية. فهو يتسم بالاختلافات التشريحية ونسيجية جنبا إلى جنب مع صعوبات التشخيص أو تشخيصية. ويتألف نظام التشغيل الخلايا السرطانية غير متجانسة جينوتيبيكالي وفينوتيبيكالي. وأثبتت العناصر المكروية العظام لحساب لتطور الورم عدم التجانس والمرض. عظم المصفوفة خارج الخلية (BEM) يحتفظ بمصفوفات ميكروستروكتورال والبيوكيميائية عناصر المصفوفة خارج الخلية الأصلية. يوفر هذا المتخصصة الخاصة بالانسجة سقالة مواتية وطويلة الأجل للخلية OS البذر وانتشار. توفر هذه المقالة بروتوكول لإعداد نموذج BEM وتطبيقه التجريبية. يمكن أن تنمو الخلايا OS وتفرق في متسقة مع تعقيد نسيجية من العينات السريرية OS متعددة تعمل. يسمح النموذج أيضا التصور مورفولوجيس المتنوعة وارتباطها مع التعديلات الوراثية والآليات التنظيمية الأساسية. كمثلي للبشرية نظام التشغيل، يمكن وضع هذا النموذج BEM-نظام التشغيل وتطبيق لعلم الأمراض والبحوث السريرية لنظام التشغيل.

Introduction

Osteosarcoma (OS) يحدث عادة في مناطق، ميتافيسيس العظام الطويلة، زراعة بنشاط خلال فترة المراهقة. أكثر من 80% المواقع المتضررة من نظام التشغيل لديها تفضيل ميتافيسيس الدانية الساق وعظم العضد الدانية، فضلا عن عظم الفخذ البعيدة والقريبة على حد سواء، المقابلة لموقع لوحة النمو1. يتألف نظام التشغيل متعددة الأنواع الفرعية الخلية مع خصائص الوسيطة وتنوع كبير في ميزات النسجية والصف. أدلة تدعم الخلايا الجذعية الوسيطة (MSCs) وخلايا الاوستيوبلاستس ملتزمة السلائف وبيريسيتيس كخلايا المنشأ2،3،،من45. هذه الخلايا يمكن أن تتراكم التعديلات الوراثية أو جينية وأن تؤدي إلى نظام التشغيل تحت تأثير بعض الإشارات ميكرونفيرونمينتال العظام. الآليات الذاتية والخارجية على السواء تؤدي إلى عدم الاستقرار المجيني والتباين في نظام التشغيل، مع عدة تعمل الخصائص المورفولوجية والسريرية6،7. للعلاجات الفردية أو فحص العقاقير الجديدة، يلزم نماذج الرواية توليدها إلى ضد عدم التجانس أو غيرها من الاضطرابات السريرية.

نظام التشغيل ورم صلبة خبيث داخل العظمى. تعقيد والنشاط المحيطة العناصر المكروية يضفي الاختلافات المظهرية والوظيفية على خلايا نظام التشغيل في مواقع مختلفة من الورم. عظم المصفوفة خارج الخلية (BEM) يوفر سقالة الهيكلية والبيوكيميائية للترسبات المعدنية وإعادة عرض العظام. الجزء العضوي من المصفوفة خارج الخلية (ECM) يتكون بشكل رئيسي من نوع أنا الكولاجين يفرز من خلايا النسب أوستيوبلاستيك، بينما حصتها غضاريف تتكون من فوسفات الكالسيوم في شكل هيدروكسيباتيت8. الدور الدينامي لشبكات إدارة المحتوى في المؤسسة لتنظيم التصاق الخلايا، التمايز، عبر الحديث والأنسجة تعمل صيانة9.

وقد استخدمت بنجاح في خلية ثقافة الهلاميات المائية BEM وإدارة المحتوى في المؤسسة ديمينيراليزيد ويمكن تعزيز خلية انتشار10،11. يمكن تنظيم المركبة مثل العظام ECM حجم التجمع، ومصير القرارات وتطور النسب MSCs12،،من1314. وعلاوة على ذلك، الأدلة النتائج أهميته السريرية لتقديم نشاط osteogenic بتحفيز العمليات الخلوية خلال العظم تشكيل وتجديد15،،من1617.

في هذه المادة، ينشئ مجموعتنا نموذج تم التعديل والبديل مواتية لثقافة طويلة الأجل ثلاثي الأبعاد. تقديم الخلايا OS حقن BEM المستمدة من الأنسجة النمط الظاهري الوسيطة بين سهولة مقارنة بالبلاستيك الثقافات ثنائي الأبعاد. BEM المستمدة من الأنسجة المتجانسة الخاصة بالموقع وتظهر ميزته درامية كما يجري مكانة أصلي لنظام التشغيل الخلايا في المختبر ويتمتع بإمكانات كبيرة في مجال البحوث النظرية والسريرية OS. هذا المنهاج بم تتسم بسيطة ولكنها فعالة للبحث في المختبر ، ويجوز تمديدها في النمذجة سرطانات متعددة.

Protocol

رعاية الحيوان واستخدام تجري وفقا “المعاهد الوطنية للصحة دليل” لرعاية واستخدام للحيوانات المختبرية (المعاهد الوطنية للصحة المنشور NO.80-23، المنقح في عام 1996) بعد الحصول على موافقة لجنة الأخلاقيات الحيوان في صن يأت-صن “جامعة”. 1-إعداد العظام الحصول على 4 إلى 6 عاماً الأسبوع با…

Representative Results

بعد القعود وديسيلولاريزيشن، يبدو أن BEM شفافة مع مرونة وتماسك العظام الماوس الأصلي بالمقارنة مع أقوى. بقايا العضلات قليلاً والفضاء من تجويف النخاع يمكن وضوح ملاحظة (الشكل 1أ، ب). لتحديد ديسيلولاريزيشن فعالة من بم، بم جزءا لا يتجزأ من البارافين بعد التثبيت، وشرائح ث…

Discussion

عموما، يمكن تصنيف نظام التشغيل كما أوستيوبلاستيك، الأنواع الفرعية تشوندروبلاستيك، و fibroblastic حسب عنصرها النسجية المسيطرة. التكهن به يعتمد ليس فقط على المعلمات النسجية بل أيضا على موقعها التشريحية. وقد يحدث داخل العظام (في إينتراميدولاري أو حجرة إينتراكورتيكال)، على أسطح العظام، وفي مواق?…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

الكتاب قيمة دعم تشن ليويينج للمساعدة الإدارية و “طويلة جاو” لها لمساعدته التقنية ممتازة أثناء تشييد السقالات المصفوفة خارج الخلية العظام. يتم اعتماد هذه الدراسة من المنح المقدمة من “مؤسسة العلوم الطبيعية الوطنية الصينية” (31871413).

Materials

15 mL centrifuge tube Greiner 188271
50 mL centrifuge tube Greiner 227270
6 cm cell culture dish Greiner 628160
6-well plate Greiner 657160
Ampicillin Sigma-Aldrich A9393
C57-BL/6J mouse Sun Yat-sen University Laboratory Animal Center
CO2 incubator SHEL LAB SCO5A
Dibasic sodium phosphate Guangzhou Chemical Reagent Factory BE14-GR-500G
DMEM/F12 Sigma-Aldrich D0547
Fetal bovine serum Hyclone SH30084.03
Hemocytometer BLAU 717805
Kanamycin Sigma-Aldrich PHR1487
MG-63 Chinese Academy of Science, Shanghai Cell Bank Human osteosarcoma cell line
MNNG/HOS Chinese Academy of Science, Shanghai Cell Bank Human osteosarcoma cell line
Phenol red Sigma-Aldrich P4633 A solution of phenol red is used as a pH indicator: its color exhibits a gradual transition from yellow to red over the pH range 6.6 to 8.0.
Potassium chloride Sangon Biotech A100395
Potassium Phosphate Monobasic Sangon Biotech A501211
Sodium chloride Sangon Biotech A501218

Riferimenti

  1. Longhi, A., Errani, C., De Paolis, M., Mercuri, M., Bacci, G. Primary bone osteosarcoma in the pediatric age: State of the art. Cancer Treatment Reviews. 32, 423-436 (2006).
  2. Mohseny, A. B., et al. Osteosarcoma originates from mesenchymal stem cells in consequence of aneuploidization and genomic loss of Cdkn2. Journal of Pathology. 219, 294-305 (2009).
  3. Mutsaers, A. J., Walkley, C. R. Cells of origin in osteosarcoma: mesenchymal stem cells or osteoblast committed cells. Bone. 62, 56-63 (2014).
  4. Sato, S., et al. Mesenchymal tumors can derive from Ng2/Cspg4-Expressing pericytes with β-Catenin modulating the neoplastic phenotype. Cell Reports. 16, 917-927 (2016).
  5. Patane, S., et al. MET overexpression turns human primary osteoblasts into osteosarcomas. Ricerca sul cancro. 66, 4750-4757 (2006).
  6. Poos, K., et al. Genomic heterogeneity of osteosarcoma – shift from single candidates to functional modules. PLoS One. 10, 123082 (2015).
  7. Martin, J. W., Squire, J. A., Zielenska, M. The genetics of osteosarcoma. Sarcoma. 2012, 1-11 (2012).
  8. Alfranca, A., et al. Bone microenvironment signals in osteosarcoma development. Cellular and Molecular Life Sciences. 72, 3097-3113 (2015).
  9. Alford, A. I., Kozloff, K. M., Hankenson, K. D. Extracellular matrix networks in bone remodeling. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 65, 20-31 (2015).
  10. Sawkins, M. J., et al. Hydrogels derived from demineralized and decellularized bone extracellular matrix. Acta Biomaterialia. 9, 7865-7873 (2013).
  11. Alom, N., Peto, H., Kirkham, G. R., Shakesheff, K. M., Bone White, L. J. Bone extracellular matrix hydrogel enhances osteogenic differentiation of C2C12 myoblasts and mouse primary calvarial cells. Journal of Biomedical Materials Research Part B-Applied Biomaterials. 106, 900-908 (2018).
  12. Datta, N., Holtorf, H. L., Sikavitsas, V. I., Jansen, J. A., Mikos, A. G. Effect of bone extracellular matrix synthesized in vitro on the osteoblastic differentiation of marrow stromal cells. Biomaterials. 26, 971-977 (2005).
  13. Rubio, R., et al. Bone environment is essential for osteosarcoma development from transformed mesenchymal stem cells. Stem Cells. 32, 1136-1148 (2014).
  14. Sadr, N., et al. Enhancing the biological performance of synthetic polymeric materials by decoration with engineered, decellularized extracellular matrix. Biomaterials. 33, 5085-5093 (2012).
  15. Gautschi, O. P., Frey, S. P., Zellweger, R. Bone morphogenetic proteins in clinical applications. Anz Journal of Surgery. 77, 626-631 (2007).
  16. Rochet, N., et al. Modification of gene expression induced in human osteogenic and osteosarcoma cells by culture on a biphasic calcium phosphate bone substitute. Bone. 32, 602-610 (2003).
  17. Spang, M. T., Christman, K. L. Extracellular matrix hydrogel therapies: in vivo applications and development. Acta Biomaterialia. 68, 1-14 (2018).
  18. Schenke-Layland, K., et al. Impact of decellularization of xenogeneic tissue on extracellular matrix integrity for tissue engineering of heart valves. Journal of Structural Biology. 143, 201-208 (2003).
  19. Klein, M. J., Siegal, G. P. Osteosarcoma: anatomic and histologic variants. American Journal of Clinical Pathology. 125, 555-581 (2006).
  20. Lipinski, K. A., et al. Cancer evolution and the limits of predictability in precision cancer medicine. Trends in Cancer. 2, 49-63 (2016).
  21. McGranahan, N., Swanton, C. Clonal heterogeneity and tumor evolution: past, present, and the future. Cell. 168, 613-628 (2017).
  22. Brown, H. K., Schiavone, K., Gouin, F., Heymann, M., Heymann, D. Biology of bone sarcomas and new therapeutic developments. Calcified Tissue International. 102, 174-195 (2018).
  23. Abarrategi, A., et al. Osteosarcoma: cells-of-origin, cancer stem cells, and targeted therapies. Stem Cells International. 2016, 1-13 (2016).
  24. Tsukamoto, S., et al. Mesenchymal stem cells promote tumor engraftment and metastatic colonization in rat osteosarcoma model. International Journal of Oncology. 40, 163-169 (2012).
  25. Rodriguez, C. J., et al. Aerosol gemcitabine: preclinical safety and in vivo antitumor activity in osteosarcoma-bearing dogs. Journal of Aerosol Medicine and Pulmonary Drug Delivery. 23, 197-206 (2010).
  26. Rodriguez, C. J. Using canine osteosarcoma as a model to assess efficacy of novel therapies: Can old dogs teach us new tricks. Advances in Experimental Medicine and Biology. 804, 237-256 (2014).
  27. Mohseny, A. B., et al. An osteosarcoma zebrafish model implicates Mmp-19 and Ets-1 as well as reduced host immune response in angiogenesis and migration. Journal of Pathology. 227, 245-253 (2012).
  28. Saalfrank, A., et al. A porcine model of osteosarcoma. Oncogenesis. 5, 210 (2016).
  29. Zhang, Y., Pan, Y., Xie, C., Zhang, Y. MiR-34a exerts as a key regulator in the dedifferentiation of osteosarcoma via PAI-1–Sox2 axis. Cell Death & Disease. 9, (2018).
  30. Hashimoto, Y., et al. The effect of decellularized bone/bone marrow produced by high-hydrostatic pressurization on the osteogenic differentiation of mesenchymal stem cells. Biomaterials. 32, 7060-7067 (2011).
  31. Benders, K. E. M., et al. Extracellular matrix scaffolds for cartilage and bone regeneration. Trends in Biotechnology. 31, 169-176 (2013).
  32. Grayson, W. L., et al. Effects of initial seeding density and fluid perfusion rate on formation of tissue-engineered bone. Tissue Engineering Part A. 14, 1809-1820 (2008).
  33. Mikulic, D., et al. Tumor angiogenesis and outcome in osteosarcoma. Pediatric Hematology and Oncology. 21, 611-619 (2004).
  34. Ren, K., et al. Vasculogenic mimicry: a new prognostic sign of human osteosarcoma. Human Pathology. 45, 2120-2129 (2014).
  35. Bonuccelli, G., et al. Role of mesenchymal stem cells in osteosarcoma and metabolic reprogramming of tumor cells. Oncotarget. 5, 7575-7588 (2014).
check_url/it/59271?article_type=t

Play Video

Citazione di questo articolo
Zhang, Y., Yao, Y., Zhang, Y. Three-Dimensional Bone Extracellular Matrix Model for Osteosarcoma. J. Vis. Exp. (146), e59271, doi:10.3791/59271 (2019).

View Video