यहाँ, हम कम टर्नअराउंड समय, कम लागत, और उच्च थ्रूपुट के लाभों के साथ एनिप्लॉयडी (पीजीटी-ए) के लिए आनुवंशिक परीक्षण के लिए एक अर्धचालक अनुक्रमण विधि पेश करते हैं।
क्रोमोसोमल एनोभॉइडी, भ्रूण विकास गिरफ्तारी, प्रत्यारोपण विफलता, या गर्भावस्था के नुकसान के लिए अग्रणी मुख्य कारणों में से एक, मानव भ्रूण में अच्छी तरह से प्रलेखित किया गया है। एनोगुणिता (पीजीटी-ए) के लिए आनुवंशिक परीक्षण एक आनुवंशिक परीक्षण है जो भ्रूण की गुणसूत्र असामान्यताओं का पता लगाने के द्वारा प्रजनन परिणामों में काफी सुधार करता है। अगली पीढ़ी अनुक्रमण (एनजीएस) आनुवंशिक विश्लेषण के लिए एक उच्च थ्रूपुट और लागत प्रभावी दृष्टिकोण प्रदान करता है और पीजीटी-ए में नैदानिक प्रयोज्यता दिखाया गया है। यहाँ, हम भ्रूण में एउप्लॉयडी की स्क्रीनिंग के लिए एक तेजी से और कम लागत वाले अर्धचालक अनुक्रमण आधारित एनजीएस विधि प्रस्तुत करते हैं। कार्यप्रवाह का पहला चरण बायोप्सी भ्रूण नमूना के पूरे जीनोम प्रवर्धन (डब्ल्यूजीए) है, जिसके बाद अनुक्रमण पुस्तकालय का निर्माण होता है, और बाद में अर्धचालक अनुक्रमण प्रणाली पर अनुक्रमण होता है। आम तौर पर, एक PGT-एक आवेदन के लिए, 24 नमूने लोड किया जा सकता है और प्रत्येक चिप पैदा करने पर अनुक्रम 60 -80 लाख 150 आधार जोड़े की एक औसत पढ़ने की लंबाई पर पढ़ता है. विधि टेम्पलेट प्रवर्धन और अनुक्रमण पुस्तकालय की समृद्धि के प्रदर्शन के लिए एक परिष्कृत प्रोटोकॉल प्रदान करता है, PGT-एक का पता लगाने reproduible, उच्च throughput, लागत कुशल, और timesaving बना रही है. इस अर्धचालक अनुक्रमक के चल रहे समय केवल 2 “4 घंटे है, 5 दिनों में रिपोर्ट जारी करने के लिए नमूने प्राप्त करने से बदलाव के समय को कम. इन सभी लाभों इस परख भ्रूण से गुणसूत्र anuploidies का पता लगाने के लिए एक आदर्श विधि बनाने के लिए और इस प्रकार, पीजीटी-ए में अपने व्यापक आवेदन की सुविधा.
सामान्य गुणसूत्र प्रतिलिपि संख्या के साथ अच्छी गुणवत्ता व्यवहार्य भ्रूण का चयन (यूलॉयड) सहायता प्राप्त प्रजनन में हस्तांतरण के लिए गर्भावस्था के परिणामों में सुधार करने में मदद करता है. परंपरागत रूप से, अच्छी तरह से स्थापित रूपात्मक ग्रेडिंग प्रणाली व्यापक रूप से अपनी आसान उपलब्धता और गैर इनवेसिव प्रकृति के कारण भ्रूण मूल्यांकन के लिए प्रयोग किया जाता है। तथापि, यह दर्शाया गया है कि आकृतिक मूल्यांकन केवल भ्रूण की गुणवत्ता1 और प्रत्यारोपण क्षमता2के बारे में सीमित जानकारी प्रदान कर सकता है। इसका एक मूलभूत कारण भ्रूणों की गुणसूत्रीय संरचना का मूल्यांकन करने में असमर्थता है।
क्रोमोसोमल एनोभॉइडी (असामान्य प्रतिलिपि संख्या गुणसूत्रों की संख्या) भ्रूण विकास गिरफ्तारी, प्रत्यारोपण विफलता या गर्भावस्था के नुकसान के लिए अग्रणी मुख्य कारणों में से एक है। एनुगुणिता की घटना मानव भ्रूण ों में अच्छी तरह से प्रलेखित की गई है, जो ब्लास्टोसिस्ट्स5में क्लीवेज-स्टेज भ्रूण3,4 और 50% $60% में 60%$70% के लिए लेखांकन है। यह, कुछ हद तक, इन-विट्रो निषेचन (आईवीएफ) उपचार की गर्भावस्था दर में सुधार करने में बाधाओं में योगदान दिया है, जो लगभग 35% $40%6,7पर बनाए रखा गया है। इसलिए, हस्तांतरण के लिए सुगुणित भ्रूण का चयन गर्भावस्था के परिणामों में सुधार के लिए फायदेमंद माना जाता है। इस उद्देश्य के लिए, एनोगुणिता (पीजीटी-ए) के लिए आनुवंशिक परीक्षण को आनुवंशिक दृष्टिकोणों का उपयोग करके भ्रूण व्यवहार्यता की जांच करने के लिए आगे विकसित किया गया है। पीजीटी-ए की महत्वपूर्ण भूमिका का समर्थन करने वाले यादृच्छिक नियंत्रित परीक्षणों और सहगण अध्ययनों की संख्या बढ़ रही है। यह साबित हो गया है कि पीजीटी-ए के आवेदन से गर्भपात की दर कम हो जाती है और नैदानिक गर्भावस्था दर और प्रत्यारोपण दर8, चल रही गर्भावस्था दर और जीवित जन्म दर9में वृद्धि होती है।
ऐतिहासिक रूप से, पीजीटी-ए में विभिन्न तरीकों को लागू किया गया है, जैसे कि सीटू हाइब्रिडाइजेशन (फिश), तुलनात्मक जीनोमिक संकरण (सीजीएच), सरणी-सीजीएच, और एकल न्यूक्लिओटाइड बहुरूपता (एसएनपी)-माइक्रोरेरे में फ्लोरोसेंट। पिछले अध्ययनों से पता चला है कि FISH द्वारा दरार चरण भ्रूण के लिए PGT-A परिणाम है कि खराब उन के साथ संगत blastcysts के अनुरूप गुणसूत्र स्क्रीनिंग (सीसीएस) द्वारा प्राप्त कर रहे हैं 59273array-CGH या का उपयोग कर परिणाम पैदावार एसएनपी-microarray5927310| इन विसंगतियों गुणसूत्र मोज़ेकवाद, FISH तकनीकी कलाकृतियों, या विकास11के दौरान गुणसूत्र अलगाव त्रुटियों के भ्रूण आत्म सुधार के लिए जिम्मेदार ठहराया जा सकता है. यह व्यापक रूप से मान्यता प्राप्त है कि सरणी-आधारित पीजीटी-ए के लिए ब्लास्टोसिस्ट ट्रोफिक्टोडर (टीई) बायोप्सी का उपयोग करना जैसे सरणी-सीजीएच या एसएनपी-माइक्रोरे, भ्रूणों में गुणसूत्र असंतुलन की पहचान करने के लिए प्रभावी है10,12. हाल ही में, एकल सेल अगली पीढ़ी अनुक्रमण (एनजीएस) आनुवंशिक विश्लेषण के लिए एक उच्च थ्रूपुट और लागत प्रभावी दृष्टिकोण प्रदान करता है और पीजीटी-ए13,14,15में नैदानिक प्रयोज्यता दिखाया गया है , जो इसे एक वर्तमान में उपलब्ध तरीकों के लिए विकल्प का वादा.
यहाँ, हम मानव भ्रूण में anuploidy की जांच के लिए एक तेजी से, मजबूत, और कम लागत अर्धचालक अनुक्रमण आधारित NGS विधि प्रस्तुत करते हैं. कार्यप्रवाह का पहला चरण बायोप्सी भ्रूण नमूना के पूरे जीनोम प्रवर्धन (WGA) है, एक एकल सेल WGA किट का उपयोग कर, अनुक्रमण पुस्तकालय के निर्माण के बाद, और अर्धचालक अनुक्रमण प्रणाली पर बाद अनुक्रमण.
डीएनए किनारा संश्लेषण के दौरान प्रत्येक deoxyribonucleoside ट्राइफॉस्फेट निगमन से जारी कर रहे हैं कि एच+ आयनों का पता लगाने के माध्यम से, प्रणाली रासायनिक संकेतों (पीएच परिवर्तन) अर्धचालक तत्वों द्वारा कब्जा कर लिया डिजिटल डेटा को निर्देशित करने के लिए स्थानान्तरण , जो आगे डीएनए अनुक्रम जानकारी में व्याख्या कर रहे हैं. महंगी ऑप्टिकल का पता लगाने और जटिल अनुक्रमण प्रतिक्रियाओं के लिए आवश्यकता को खत्म करने, इस सरल अनुक्रमण रसायन विज्ञान कुल अभिकर्मक लागत कम कर देता है और अनुक्रमण चल समय में shortens 2 $4 घंटे16. इससे भी महत्वपूर्ण बात, निर्माता के प्रदर्शन विनिर्देशों के आधार पर, अर्धचालक अनुक्रमण मंच अप करने के लिए उत्पन्न कर सकते हैं 15 जीबी अनुक्रमण डेटा (पुस्तकालय की गुणवत्ता पर निर्भर करता है) प्रति रन, जो अन्य seuencers में से कुछ की तुलना में काफी अधिक है केवल लगभग 3 “4 जीबी डेटा का उत्पादन (2 x 75 बीपी पढ़ने की लंबाई के साथ)17. पीजीटी-ए के नैदानिक अनुप्रयोगों में, इस मंच को 80 लाख तक पैदा चिप प्रति 24 नमूने प्राप्त कर सकते हैं पढ़ताहै 17 पढ़ता है और कम से कम एक लाख प्रत्येक नमूने के अद्वितीय पढ़ता है. पढ़ें गहराई सुनिश्चित कर सकते हैं कि प्रत्येक नमूना कम से कम 0.05x पूरे जीनोम कवरेज है. इस मंच के ऊपर लाभ यह एक आदर्श स्क्रीनिंग विधि बनाने के लिए और इस प्रकार, पीजीटी-ए18में अपने व्यापक अनुप्रयोगों की सुविधा.
अन्य अनुक्रमण रसायनज्ञों से भिन्न, यहाँ वर्णित अनुक्रमक न्यूक्लियोटाइडों का पता लगाने के लिए अर्धचालक का उपयोग करता है। चिप ही एक इलेक्ट्रॉनिक उपकरण है कि polymerase संचालित आधार निगमन17,जो Proton कार्?…
The authors have nothing to disclose.
इस अध्ययन को हांगकांग से जनरल रिसर्च फंड (रेफ नंबर 14162417) द्वारा समर्थित किया गया था, चीन के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (रेफ नंबर 81860272), प्रांतीय विज्ञान और प्रौद्योगिकी फाउंडेशन के प्रमुख अनुसंधान योजना गुआंगशी (रेफ नं. AB16380219), और चीन पोस्टडॉक्टोरल साइंस फाउंडेशन ग्रांट (रेफ नंबर 2018M630993) चीन से।
PCR tubes, 0.2 mL | Axygen | PCR-02D-C | |
UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0 | ThermoFisher | 15575020 | |
PBS, pH 7.4, Ca2+ and Mg2+ free | ThermoFisher | 10010023 | |
1.0 M NaOH (1.0N) solution | SIGMA-ALDRICH | S2567 | For Melt-off solution. Molecular grade |
Eppendorf LoBind Tubes, 1.5 mL | Fisher Scientific | 13-698-791 | |
Ion Plus Fragment Library Kit | ThermoFisher | 4471252 | |
ELGA PURELAB Flex 3 Water Purification System or Equivalent 18 MΩ water system |
ThermoFisher | 4474524 | |
Ion Plus Fragment Library Kit | ThermoFisher | 4471252 | |
PicoPLEX WGA Amplification buffer | Rubicon Genomics | R30050 | This can be replaced by SurePlex DNA Amplification System,catalog number: PR-40-415101-03. |
PicoPLEX WGA Amplification enzyme | Rubicon Genomics | R30050 | This can be replaced by SurePlex DNA Amplification System,catalog number: PR-40-415101-03. |
Ion OneTouch Amplification Plate | In kit: Ion OneTouch 2 Supplies (Part No. A26367). Extended kit component in Sheet 5 | ||
Ion PI Annealing Buffer | |||
MyOne Beads Capture Solution | |||
Agilent 2100 Bioanalyzer instrument | Agilent | G2939AA | |
Ion OneTouch Breaking Solution (black cap) | In kit: Ion PI Hi‑Q OT2 Solutions 200 (Part No. A26429). Extended kit component in Sheet 5 | ||
Dynabeads MyOne Streptavidin C1 | ThermoFisher | 65001 | |
PicoPLEX WGA Cell extraction buffer | Rubicon Genomics | R30050 | This can be replaced by SurePlex DNA Amplification System,catalog number: PR-40-415101-00. |
PicoPLEX WGA Cell extraction enzyme | Rubicon Genomics | R30050 | This can be replaced by SurePlex DNA Amplification System,catalog number: PR-40-415101-03. |
Ion PI Chip Kit v3 | ThermoFisher | A26771 | |
Ion Chip Minifuge, 230 V | ThermoFisher | 4479673 | |
Ion PI dATP | ThermoFisher | A26772 | |
Ion PI dCTP | ThermoFisher | A26772 | |
Ion PI dGTP | ThermoFisher | A26772 | |
Ion Plus Fragment Library Kit | ThermoFisher | 4471252 | |
Ion Plus Fragment Library Kit | ThermoFisher | 4471252 | |
ThermoQ–Temperature Dry Bath | TAMAR | HB-T2-A | |
NEBNext dsDNA Fragmentase | New England Biolabs | M0348L | |
NEBNext dsDNA Fragmentase | New England Biolabs | M0348L | |
Ion PI dTTP | ThermoFisher | A26772 | |
Ion OneTouch 2 Instrument | ThermoFisher | INS1005527 | ThermoFisher Catalog number: 4474778. |
Ion Plus Fragment Library Kit | ThermoFisher | 4471252 | |
Ion One Touch ES | ThermoFisher | 8441-22 | ThermoFisher Catalog number: 4469495. Extended kit component in Sheet 5 |
Ethanol | SIGMA-ALDRICH | 51976 | This can be replaced by any brand's molecular grade absolute ethanol. |
PicoPLEX WGA Extraction enzyme dilution buffer | Rubicon Genomics | R30050 | This can be replaced by SurePlex DNA Amplification System,catalog number: PR-40-415101-01. |
PicoPLEX WGA Extraction enzyme dilution buffer | Rubicon Genomics | R30050 | This can be replaced by SurePlex DNA Amplification System,catalog number: PR-40-415101-02. |
Qubit 3.0 Fluorometer | ThermoFisher | Q33216 | This model has been replaced by Qubit 4 Fluorometer, Catalog number: Q33226. |
Qubit ds DNA HS Assay kit | ThermoFisher | M2002-02 | |
Qubit Assay Tubes | ThermoFisher | Q32856 | |
Ion PI Foaming Solution | ThermoFisher | A26772 | |
Index for barcoding of libraries | BaseCare | this is a in-house prepared index. Users can buy commercial product from ThermoFisher Ion Xpress Barcode Adapters Kits (Cat. No. 4474517) | |
Ion PI Loading Buffer | ThermoFisher | A26772 | |
Solid(TM) Buffer Kit-1X Low TE Buffer | ThermoFisher | 4389764 | |
Agencour AMPure XP Kit | Beckman Coulter | A63880 | |
DynaMag-2 magnet (magnetic rack) | ThermoFisher | 12321D | |
Ion PI Master Mix PCR buffer | |||
Sorvall Legend Micro 17 Microcentrifuge | Micro 17 | 75002430 | |
Ion Plus Fragment Library Kit | ThermoFisher | 4471252 | |
Nuclease-free water | ThermoFisher | AM9922 | This can be replaced by other brand. |
PicoPLEX WGA Nuclease-free water | Rubicon Genomics | R30050 | This can be replaced by SurePlex DNA Amplification System,catalog number: PR-40-415101-03. |
Ion OneTouch Oil bottle | Ion PI Hi‑Q OT2 Solutions 200 (Part No. A26429). Extended kit component in Sheet 5 | ||
Ion Plus Fragment Library Kit | ThermoFisher | 4471252 | Extended kit component in Sheet 3 |
double-strand DNA standard | This is a in-house prepared DNA standard for calibration of Qubit before quantification of library. | ||
PicoPLEX WGA Preamplification buffer | Rubicon Genomics | R30050 | This can be replaced by SurePlex DNA Amplification System,catalog number: PR-40-415101-03. |
PicoPLEX WGA Preamplification enzyme | Rubicon Genomics | R30050 | This can be replaced by SurePlex DNA Amplification System,catalog number: PR-40-415101-03. |
Library Amplification Primer Mix | ThermoFisher | 4471252 | Extended kit component in Sheet 3 |
Ion OneTouch Reaction Filter | Extended kit component in Sheet 5 | ||
Recovery Router | Extended kit component in Sheet 5 | ||
Recovery Tubes | Extended kit component in Sheet 5 | ||
ISP Resuspension Solution | |||
Ion Proton | ThermoFisher | DA8600 | This model is imported by Da An Gene Co.,LTD. of Sun Yat-Sen University from ThermoFisher and has been certified by China Food and Drug Administration for clinical application. The catalog number in ThermoFisher is 4476610. |
Ion PI Hi‑Q Sequencing Polymerase | ThermoFisher | A26772 | |
Ion PI Sequencing Primer | |||
server for sequencer | Lenovo | T260 | |
Ion PI Sphere Particles | |||
Platinum PCR SuperMix High Fidelity | ThermoFisher | 4471252 | |
Nalgene 25mm Syringe Filters | ThermoFisher | 724-2045 | Pore size: 0.45μm. Specifically for aqueous fluids. |
Ion PI Hi‑Q W2 Solution | ThermoFisher | A26772 | |
Ion PI 1X W3 Solution | ThermoFisher | A26772 | |
Ion OneTouch Wash Solution C1 | |||
The Ion PGM Hi‑Q View Sequencing Kit | ThermoFisher | A30044 | Extended kit component in Sheet 2 |
Ion Plus Fragment Library Kit | ThermoFisher | 4471252 | Extended kit component in Sheet 3 |
Ion PI Hi-Q Sequencing 200 Kit (1 sequencing run per initialization) | ThermoFisher | A26772 | Extended kit component in Sheet 4 |
Ion PI Hi‑Q OT2 200 Kit | ThermoFisher | A26434 | Extended kit component in Sheet 5 |