Her beskriver vi en metode for høyoppløselig tidsforløp multiphoton avbildning av hjernetumor celler før og etter invasiv kirurgisk intervensjon (f.eks. biopsi) i det samme levende dyret. Denne metoden gjør det mulig å studere virkningen av disse invasive kirurgiske prosedyrer på tumorceller ‘ trekk, invasiv, og proliferativ atferd på et enkelt cellenivå.
Biopsier er standard omsorg for kreft behandling og er klinisk gunstig som de tillater solid tumor diagnose, prognose, og personlig behandling besluttsomhet. Men forstyrrelsene av tumor arkitekturen ved biopsi og andre invasive prosedyrer har blitt assosiert med uønskede effekter på tumorprogresjon, som må bli studert i dybden for å ytterligere forbedre den kliniske nytten av disse prosedyrene. Konvensjonelle statiske tilnærminger, som bare gir et øyeblikksbilde av svulsten, er begrenset i sin evne til å avdekke virkningen av biopsi på tumor celle atferd som migrasjon, en prosess nært knyttet til tumor kreft. Spesielt tumor celle migrasjon er nøkkelen i svært aggressive hjernesvulster, der lokale tumor formidling gjør total tumor reseksjon praktisk talt umulig. Utviklingen av multiphoton tenkelig og kronisk tenkelig Vinduer innrømmer Naturvitenskapelig å studere denne drivkraft forarbeide inne lever dyrene over tid. Her beskriver vi en metode for høy oppløsning langsgående avbildning av hjernetumor celler før og etter en biopsi i samme levende dyr. Denne tilnærmingen gjør det mulig å studere virkningen av denne prosedyren på tumor celle atferd (migrasjon, invasjon og spredning). Videre diskuterer vi fordeler og begrensninger av denne teknikken, samt evnen til denne metodikken å studere endringer i kreftcelle atferden for andre kirurgiske inngrep, inkludert tumor reseksjon eller implantation av kjemoterapi Wafere.
Standard for omsorg for de fleste solide svulster inkluderer vev biopsi for diagnose, prognose, og personlig behandling bestemmelse1,2. Samlet disse prosedyrene gir klinisk nytte, men nyere bevis indikerer at biopsi og andre mer invasive prosedyrer, slik som tumor reseksjon, kan også negativt påvirke tumorprogresjon3,4,5 , 6. selv om disse prosedyrene forblir uunnværlig i-pasientbehandling og deres fordeler overvinne sine negative virkninger, er det nødvendig å fullt ut forstå mekanismene bak disse negative effektene for å maksimere pasientenes sikkerhet og positive påvirkninger av disse prosedyrene og gjøre dem enda mer klinisk fordelaktig.
Biopsi-mediert uønskede effekter på tumorprogresjon utløses av systemiske endringer og endringer i tumor mikromiljøet som svar på vevs forstyrrelser4,5. Således, det er en på krevd å studere denne forarbeide inne bo dyrene. Imidlertid kan de subtile konsekvensene av disse minimalt invasive prosedyrer ofte være forkledd av store variasjoner mellom individer. Konvensjonelle metoder basert på immunhistokjemi eller transcriptional uttrykks analyse kan overse disse effektene eller kreve et stort antall dyr for å identifisere dem. Videre disse statiske tilnærminger mangler evnen til å identifisere endringer i tumor celle atferd som migrasjon og invasjon, dynamiske prosesser som samsvarer med tumor kreft. Disse tumor celle funksjoner er av særlig betydning for svært aggressive hjernesvulster, slik som glioblastom multiforme (GBM), hvor den lokale spredningen av tumorceller begrenser kirurgisk reseksjon og reduserer pasient overlevelse7. For fullt ut å forstå hvordan biopsier påvirker atferden til GBM-celler, er en langsgående tilnærming som tillater visualisering av disse cellene i den fysiologiske konteksten av levende organismer nødvendig.
Den nylige utviklingen av høyoppløselig intravital Imaging i kombinasjon med kirurgisk implantert kronisk Imaging Windows tillater forskere å studere den dynamiske atferden til tumorceller i levende mus over flere dager8,9. Ved hjelp av denne kraftige tilnærmingen, kan vi studere hvordan tumorceller ‘ proliferativ, trekk, og infiltrerende atferd endringer over flere dager som svar på en biopsi i samme mus. Sammenlignet med andre teknikker som tillater flere dagers overvåking av svulster i levende mus, for eksempel magnetisk resonans imaging (MRI)10, positron utslipp tomografi/beregnet TOMOGRAFI (pet/CT)11, eller Puerto Mosquito Imaging12, dette tilnærming unikt tilbyr muligheten for å studere tumor celle atferd på enkelt cellenivå og unraveling subtile endringer som forekommer i svulsten.
Her beskriver vi en detaljert metode for å utføre biopsi-lignende skade og pre-og postbiopsy langsgående intravital Imaging i hjernen av tumor-bærende mus. Denne metoden kan potensielt brukes til å studere andre kirurgiske inngrep, for eksempel delvis tumor reseksjon eller implantation av kjemoterapi wafere.
Her beskriver vi en metode for å studere endringer i tumor celle adferd på enkelt cellenivå som svar på invasive kirurgiske prosedyrer, for eksempel en biopsi, i hjernen til et levende dyr. Kombinasjonen av langsgående multiphoton Imaging med kirurgisk implantation av en kronisk veiviseren muliggjør kvantifisering av tumor celle migrasjon, invasjon og spredning før og etter biopsi i samme dyr4. Sammenlignet med andre tilnærminger som brukes for tumor multiday overvåking, for eksempel Puerto Mosquito Imaging12, Mr10, eller pet/CT11, denne metoden unikt visualiserer svulster på en enkelt cellenivå og dermed gir innsikt i cellulære atferd underliggende tumorprogresjon.
For å kunne utføre denne metoden, bør flere prosedyrer bli mestret. De mest kritiske trinnene i denne protokollen er implementering av veiviseren og utskifting. Den tekniske kompleksiteten i disse trinnene krever presisjon og kirurgiske ferdigheter som kan oppnås med jevn trening. Komplikasjoner under veiviseren for tilpasset installasjon, for eksempel blødning som kan dekke hjernens overflate, kan vise seg å være utfordrende for påfølgende bildebehandling. Mangel på sterile verktøy eller miljø, samt unnlatelse av å helt forsegle hjernens overflate, kan forårsake en infeksjon på hjernen overflaten (hvit væske under dekkglass), som vil gjøre Imaging problematisk og sterkt kompromiss den resulterende Tolkning. Et annet vanlig nummer av denne protokollen er dyr bevegelse i løpet av time-lapse Imaging. Mens noen XYZ Skift kan korrigeres etter eksperimentet, anbefales det å korrigere koordinaten til hver posisjon før hver gang-punkt for å hindre tap av informasjon. Tissue deformasjon er et ekstra problem funnet når Imaging på en invertert mikroskop. Hjernevevet lider av kompresjon når musen er plassert i liggende posisjon. Avhengig av graden av vev deformasjon, kan tumor celle sporing føre til en feilaktig kvantifisering av celle forskyvning. For å hindre dette, kan en programvare for stiv og elastisk deformasjon brukes14.
Selv om denne prosedyren tilbyr et bredt program for å studere endringer i tumor atferd, bør visse begrensninger vurderes. Denne metoden gjør det mulig for forskere å bilde opp til en dybde på 1,6 mm (med bruk av en optisk parametrisk oscillator); Dette betyr imidlertid at bildebehandling er begrenset til overfladiske hjerne cortex områder15. Således, noe hjernesvulst lokalisert inne dyp hjerne strukturer, inkluderer diffus iboende Pontine gliomas lokalisert inne det hjernestammen område, kan ikke være studert inne deres original hjerne omgivelsene med dette protokollen. En annen begrensning av denne protokollen er volumet av svulsten som kan bli avbildet. Selv om total svulst volum skanning er ønskelig å få maksimal informasjon, ofte, tumor størrelse og hastigheten på trekk celler kan være Begrensende faktorer. For hver tumor type må det vurderes en optimal tidsforløp for bildebehandling. Hvis tidsrammen mellom bildene er for lang, kan det være vanskelig å spore tumorceller. Bruken av en resonans skanner kan sterkt redusere skanningen tid, slik at Imaging av en større svulst16. Endelig kan den manuelle bildeanalyse av denne protokollen være svært tidkrevende, så i stedet, programmer for automatisert 3D-sporing kan brukes. Imidlertid bør utfallet av sporing alltid være visuelt overvåket siden algoritmer for automatisert celle sporing er sjelden utformet for å recapitulate nøyaktig migrering av cellene av interesse.
Små tilpasninger av protokollen beskrevet her kan aktivere et enda bredere spekter av applikasjoner. I stedet for å utføre biopsier, kan andre (kirurgiske) intervensjoner implementeres, slik som delvis tumor reseksjon eller levering av kjemoterapi wafere. Tilsetning av forbindelser gjennom en kirurgisk implantert microtube kan kombineres med denne protokollen for å farmakologisk målrette bestemte molekyler av interesse. Vi forventer at denne modellen vil være nyttig i studier som tar sikte på å analysere virkningen av en viss intervensjon på tumor celle atferd. Muligheten for å utføre gjentatte tiltak i samme dyret gir ikke bare mer nøyaktige data om endringer som forekommer i svulsten, men også i stor grad reduserer antall forsøksdyr som trengs per studie.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne takker anko de Graaff og Hubrecht Imaging Center for deres Imaging støtte og Ellen Wehrens og Hannah Johnson for korrekturlesing og redigering av manuskriptet.
25g x 16 mm hypodermic needles | BD Microlance | 300600 | |
701 RN 10uL SYR W/O NEEDLE | Hamilton | 7635-01 | |
Absorbable gelatin sponge | Pfizer | Gelfoam | |
Coverslips round 6 mm | VWR international | 631-0168 | |
Cyanoacrylate glue | Pattex | Pattex Ultra gel | |
Dental cement | Vertex Dental | Vertex Self-Curing | |
Drill | Dremel | Dremel 3000 (dental drill may be more convenient) + 105 Engraving Cutter | |
Fine curved Tweezers | Dumont | AGT508 | |
Hypnorm | VetaPharma Ltd | Hypnorm (Fentanyl citrate 0,315 mg/ml+ Fluanison 10 mg/ml) | |
Midazolam | Actavis | Midazolam Actavis 5mg/ml | |
Opthalmic ointment | Kela Veterinaria | Duodrops veter kela 10 m | |
Quintessential Stereotaxic Injector (QSI) | Stoelting | 53311 | |
Silicone Oil | Sigma Aldrich | 181838 | |
Stereotaxic frame | Stoelting | Lab standard stereotaxic, rat and mouse | |
Surgical stereo microscope | Olympus | ||
Temgesic (0.3 mg/ml) | BD Pharmaceuticals | 283732 | |
Vannas Tübingen Spring Scissors | Harvard Apparatus | 72-8508 | |
Xylocaine (Lidocaine 1% + Epinephrine 1:100,000) Local anesthetic | Astrazeneca | Xylocaine (Lidocaine 1% + Epinephrine 1:100,000) |