قياس الألوان "التحليل من القلوية الفوسفاتيز النشاط" في المذهبة س. بيوفيلم
Summary
في هذه المخطوطة، قمنا بإنشاء أسلوب عالية إنتاجية تحديد مقدار النشاط الفوسفاتيز القلوية في المذهبة س. بيوفيلم الثقافة من لوحة زراعة الأنسجة 96-جيدا
Abstract
الفوسفاتيز القلوية (حزب العمال الأسترالي) إنزيم مشتركة المعرب عنها في الخلايا بدائية النواة وحقيقية النواة على حد سواء. أنه يحفز التحلل المائي للفوسفات مونوستيرس من العديد من الجزيئات في الأس الهيدروجيني القاعدي ويلعب دوراً لا غنى عنه في استقلاب الفوسفات. في البشر، وألب حقيقية النواة واحدة من الإشارات الانزيمية الأكثر استخداماً في تشخيص الأمراض المختلفة، مثل ركود صفراوي والكساح. في س. تم الكشف عن المكوّرات، الب حصرا على غشاء الخلية؛ وأعربت هو أيضا كنموذج افرازية، وكذلك. ومع ذلك، يعرف الكثير عن وظيفتها في تشكيل بيوفيلم.
والغرض من هذه المخطوطة هو القيام مقايسة سريعة ويمكن الاعتماد عليها لقياس نشاط حزب العمال الأسترالي في المذهبة س. بيوفيلم التي لا تتطلب عزل البروتين. استخدام الفوسفات p-نيتروفينيل (بنب) كركيزة، قمنا بقياس نشاط حزب العمال الأسترالي في المذهبة س. بيوفيلم شكلت في لوحات زراعة الأنسجة 96-جيدا. نشاط يستند تشكيل رد فعل للذوبان المنتج تقاس 405 نانومتر امتصاص. طبيعة إنتاجية عالية الأسلوب لوحة 96 زراعة الأنسجة جيدا يوفر طريقة حساسة واستنساخه لفحوصات نشاط حزب العمال الأسترالي. كما يمكن توسيع نفس تجريبي إعداد لقياس المؤشرات الجزيئية خارج الخلية الأخرى المتصلة بتشكيل بيوفيلم.
Introduction
وأعرب الفوسفاتيز القلوية (حزب العمال الأسترالي) هو أوبيكويتوسلي في كل خلايا بدائية وحقيقية النواة1. فإنه يمكن تحفيز التحلل الأدينوزين من جزيئات مختلفة مثل النيوكليوتيدات والقلويات، استرات الفوسفات والبروتينات أو أملاحه من حامض الفوسفوريك. في البشر، وألب حقيقية النواة الحالية في العديد من الأنسجة بما فيها الكبد والعظام و الأمعاء والمشيمة2. وهي تلعب أدواراً هامة في الفسفرة البروتين ونمو الخلايا، والمبرمج، وعمليات الخلايا الجذعية، فضلا عن تمعدن الهيكل العظمى العادي. الب حقيقية النواة أيضا مؤشر مصل رئيسية لوجود أمراض في العظام والكبد والأنسجة/الأجهزة الأخرى عند ارتفاع3،4.
تم الكشف عن الب بدائية في مجموعة متنوعة من الخلايا البكتيرية، بما في ذلك كولاي5و المذهبة س.6،7 وبعض البكتريا الكرش الشائعة في التربة8. وقد استخدمت البكتيرية الب النشاط بيوسينسور في الكشف عن مبيدات الآفات والمعادن الثقيلة9 والتلوث البكتيري10. وقد استخدمت التعبير التأسيسي لحزب العمال الأسترالي لتحديد العنقوديات11 والتفريق بين السراتية عن12. ومن المقترح كذلك أن التأسيسي الب الإنتاج يرتبط بالقدرة الإمراضية في العنقوديات13. على الرغم من أن حزب العمال الأسترالي ودرست في إعدادات مختلفة3،4، بعد قليل يقال للدالة في الثقافات الأغشية الحيوية والنشاط.
وتم توثيق بيوفيلم لحياة بكتيرية تعمل بشكل مختلف بالمقارنة نظيره الخلايا البكتيرية الشرانق14. في المذهبة س.، تم التعرف على تشكيل بيوفيلم في مجموعة متنوعة من الظروف السريرية وحسابات لمقاومة المضادات الحيوية والتهاب مزمن15،16. أبلغ العديد من الجزيئات التي يمكن العثور عليها في مصفوفة بيوفيلم مثل السكريات والبروتينات والأحماض النووية والدهون، ولكن هذه الآلية لتشكيل بيوفيلم ليست مفهومة تماما14. لفهم دور الب في تشكيل بيوفيلم، مثقف الأغشية الحيوية في المذهبة س. في 96 زراعة الأنسجة ولوحات، وقياس النشاط الب باستخدام الفقرة–نيتروفينيلفوسفاتي (بنب).
بنب جزيء هو ركيزة جاهزة للاستخدام لحزب العمال الأسترالي، وقد استخدمت على نطاق واسع لقياس الب النشاط6،،من1718. يستند هذا الفحص اللونية تحويل فوسفات نيتروفينيل الفقرة (بنب) إلى الفقرة-نيتروفينول أسفر عن منتج ملونة في 405 نانومتر. مقارنة بسائر الإنزيم الب التقليدية، مثل [اغروس] هلام التفريد19، جرثومة القمح أجلوتينين (WGA) هطول الأمطار، ووغ-[هبلك]20، هذا التحليل محددة للغاية، حساسة، سهلة للتكاثر، ومعظم الأهم من ذلك، يسمح لارتفاع سرعة النقل.
Protocol
Representative Results
Discussion
في أعمالنا المقايسة، استخدمنا بنب الركيزة الب. هذا حل عمل المصممة لإليزا ولا تمييع المسبق. بعد التحلل من حزب العمال الأسترالي، يطور منتج أصفر ويمكن أن يقاس في 405 نانومتر. في نهاية رد فعل الانزيمية، نحن بإيجاز تثفيل 96 لوحة جيدا ونقل المادة طافية إلى صفيحة جيدا 96 جديدة لقياس امتصاص استخدام قا…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونحن نشكر وليام Rainey هاربر كلية وجامعة إلينوي في شيكاغو لمرفق لإجراء هذه التجارب. كما نشكر “مؤسسة ماكجرو هيل” على دعمها السخي.
Materials
| Agar | VWR | 9002-18-0 | |
| Eppendorf Centrifuge | Thomas Scientific | 5810 | |
| Gluose | VWR | 50-99-7 | |
| NaOH pellets | VWR | SS0550-500GR | |
| Para-nitrophenylphosphate (pNPP) | Sigma | P7998-100ML | Typical concentrations of pNPP liquid substrates, often used in enzyme-linked immunesorbent assays (ELISA), range between 10 to 50 mM. Similar to most ready-to-use pNPP liquid substrates like the one used here, the exact pNPP concentration is not disclosed due to its proprietary nature. |
| 10X PBS, pH7.4. 173 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 8 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4 |
Sigma | P3288-1VL | |
| Plate Reader | Biotek | ELx808 | |
| S. aureus | ATCC | ATCC25923 | |
| Tryptic Soy Agar 15g / L TSB | VWR | 9002-18-0 | |
| Tryptic Soy Broth: g/L Pancreatic Digest of Casein………… 15.0 Papaic Digest of Soyben Meal………5.00 Sodium chloride………………………… 3.00 Dextrose…………………………………. 2.50 Dipotassium phosphate………………2.50 |
VWR | 90006-098 | |
| 96 well tissue culture plates | BD | 6902D09 | U shaped bottom |
Riferimenti
- Coleman, J. Structure and mechanism of alkaline phosphatase. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 21, 441-483 (1992).
- Sharma, U., Pal, D., Prasad, R. Alkaline Phosphatase: An Overview. Indian Journal of Clinical Biochemistry. 29 (3), 269-278 (2014).
- Mitchell, M. S., et al. High frequencies of elevated alkaline phosphatase activity and rickets exist in extremely low birth weight infants despite current nutritional support. Boston Medical Center Pediatrics. 9, 47 (2009).
- Fawley, J., Gourlay, D. Intestinal alkaline phosphatase: A summary of its role in clinical disease. Journal of Surgical Research. 202 (1), 225-234 (2016).
- Derman, A. I., Beckwith, J. Escherichia coli Alkaline Phosphatase Localized to the Cytoplasm Slowly Acquires Enzymatic Activity in Cells Whose Growth Has Been Suspended: a Caution for Gene Fusion Studies. Journal of Bacteriology. 177 (13), 3764-3770 (1995).
- Danikowski, K. M., Cheng, T. Alkaline Phosphatase Activity of Staphylococcus aureus grown in Biofilm and Suspension Cultures. Current Microbiology. 75, 1226-1230 (2018).
- Okabayashi, K., Futai, M., Mizuno, S. Localization of Acid and Alkaline Phosphatases in Staphylococcus aureus. Japanese Journal of Microbiology. 18 (4), 287-294 (1974).
- Cheng, K. J., Costerton, J. W. Alkaline Phosphatase Activity of Rumen Bacteria. Applied and Environmental Microbiology. , 586-590 (1997).
- Berezhetskyy, A. L., et al. Phosphatase conductometric biosensor for heavy-metal ions determination. Innovation and Research in Biomedical Engineering. 29 (2-3), 136-140 (2008).
- Park, E. J., Kang, D. H. The use of bacterial alkaline phosphatase assay for rapid monitoring of bacterial counts on spinach. Journal of Food Science. 73 (5), M236-M238 (2008).
- Barber, M., Kuper, S. W. A. Identification of Staphylococcus pyogenes by the phosphatase reaction. The Journal of Pathology and Bacteriology. 63, 65-68 (1951).
- Wolf, P. L., Von der Muehll, E., Ludwick, M. A new test to differentiate Serratia from Enterobacter. American Journal of Clinical Pathology. 56, 241-243 (1972).
- Rangam, C. M., Katdare, S. M. Phosphatase activity of Staphylococci as an indication of their pathogenicity. Indian Journal of Medical Science. 8, 610-613 (1954).
- Flemming, H. -. C., et al. Biofilms: an emergent form of bacterial life. Nature Reviews Microbiology. 14, 563-575 (2016).
- Hoiby, N., Bjarnsholt, T., Givskov, M., Molin, S., Ciofu, O. Antibiotic resistance of bacterial biofilms. International Journal of Antimicrobial Agents. 35, 322-332 (2010).
- Ito, A., Taniuchi, A., May, T., Kawata, K., Okabe, S. Increased antibiotic resistance of Escherichia coli in mature biofilms. Applied and Environmental Microbiology. 75, 4093-4100 (2009).
- Witherow, S. A Ten-Week Biochemistry Lab Project Studying Wild-Type and Mutant Bacterial Alkaline Phosphatase. Biochemistry and Molecular Biology Education. 44 (6), (2016).
- Henthorn, P., Zervos, P., Raducha, M., Harris, H., Kadesch, T. Expression of a human placental alkaline phosphatase gene in transfected cells: Use as a reporter for studies of gene expression. Proceedings of the National Academy of Science USA. 85, 6324-6346 (1988).
- Horney, B. S., Farmer, A. J., Honor, D. J., MacKenzie, A., Burton, S. Agarose gel electrophoresis of alkaline phosphatase isoenzymes in the serum of hyperthyroid cats. Veterinary Clinical Pathology. 23 (3), 98-102 (1994).
- Farley, J. R., et al. Quantification of Skeletal Alkaline Phosphatase in Osteoporotic Serum by Wheat Germ Agglutinin Precipitation, Heat Inactivation, and a Two-Site Immunoradiometric Assay. Clinical Chemistry. 40 (9), 1749-1756 (1994).
- O’Toole, G. A. Microtiter Dish Biofilm Formation Assay. Journal of Visualized Experience. , (2011).
- Nomoto, M., Ohsawa, M., Wang, H. L., Chen, C. C., Yeh, K. W. Purification and Characterization of Extracellular Alkaline Phosphatase from an Alkalophilic Bacterium. Agricultural and Biological Chemistry. 52 (7), 1643-1647 (1988).
