金黄色葡萄球菌生物膜碱性磷酸酶活性的比色法分析
Summary
在这篇手稿中, 我们建立了一个高吞吐量的方法来量化碱性磷酸酶活性的金黄色葡萄球菌生物膜培养96孔组织培养板
Abstract
碱性磷酸酶 (ALP) 是一种常见的酶, 表达在原核细胞和真核细胞中。它催化了在碱性 ph 值下从许多分子中水解的一酯磷酸酯, 并在磷酸盐代谢中起着不可或缺的作用。在人类中, 真核 ALP 是诊断各种疾病 (如胆汁淤积和软骨病) 最常用的酶信号之一。在s.金黄色葡萄球菌, alp 是完全在细胞膜上检测到的;它也被表达为一个分泌形式, 以及。然而, 人们对它在生物膜形成中的作用了解甚少。
这份手稿的目的是开发一种快速可靠的检测方法, 以测量不需要蛋白质分离的金黄色葡萄球菌生物膜中的 alp 活性。以对硝基苯磷 (pNPP) 为底物, 测定了96孔组织培养板中形成的金黄色葡萄球菌生物膜中的 alp 活性。活性是基于可溶性反应产物的形成测量 405 nm 吸收。96井组织培养板方法的高吞吐量特性为 ALP 活性检测提供了一种灵敏、可重复的方法。同样的实验设置也可以扩展到测量与生物膜形成有关的其他细胞外分子标记。
Introduction
碱性磷酸酶 (ALP) 在原核细胞和真核细胞1中普遍表达。它可以催化不同分子的单磷酸盐水解, 如核苷酸、蛋白质、生物碱、磷酸和酸酐。在人类中, 真核 ALP 存在于许多组织中, 包括肝脏、骨骼、肠道和胎盘2。它在蛋白质磷酸化、细胞生长、凋亡、干细胞过程以及正常的骨骼矿化中起着重要作用。真核 alp 也是骨、肝脏和其他组织器官升高时存在疾病的关键血清指标.
原核 alp 已在各种细菌细胞中检测到, 包括大肠杆菌 5、金黄色葡萄球菌6、7和土壤中一些常见的瘤胃细菌8。细菌 ALP 活性已被用作检测农药、重金属9和细菌污染10的生物传感器。利用 ALP 的本构表达法鉴定葡萄球菌11 和区分沙雷氏菌和肠杆菌12。进一步指出,本构 alp 的产生与葡萄球菌13的致病性有关。虽然 alp 在不同的环境中已经被研究了3,4, 但很少报告其在生物膜培养中的活动和功能。
据记录, 与自由生活的细菌细胞对照14相比, 生物膜具有不同的细菌寿命.在金黄色葡萄球菌中, 生物膜的形成已被确定在各种临床条件下, 并解释了抗生素耐药和慢性炎症 15,16。据报道, 许多分子在生物膜基质中被发现, 如多糖、蛋白质、核酸和脂类, 但生物膜的形成机制尚不完全清楚 14.为了了解 ALP 在生物膜形成中的作用, 我们在96个井组织培养板中培养了金黄色葡萄球菌生物膜, 并使用对硝基苯磷酸酯 (pNPP) 测定了 alp 活性。
分子 pNPP 是 alp 的现成基板, 已被广泛用于测量 alp 活性6,17, 18.这种比色测定的基础是将对硝基苯磷酸酯 (pNPP) 转化为对硝基酚, 使有色产品的含量达到405纳米。与其他传统的 ALP 检测方法相比, 如琼脂糖凝胶电泳19、小麦胚芽凝集素 (wga) 沉淀和 WGA-HPLC20, 该检测方法具有高度的特异性、敏感性、易于繁殖性, 最重要的是, 允许高吞吐量。
Protocol
Representative Results
Discussion
在我们的检测中, 我们使用 pNPP 作为 ALP 底物。这是一个为 ELISA 设计的工作解决方案, 不需要稀释。在 ALP 水解后, 黄色产物会产生, 并可在405纳米处进行测量。在酶反应结束时, 我们对96井板进行了短暂的离心, 并将上清液转移到一个新的96井板上, 用板读取器测量吸收率。我们发现, 这种额外的离心步骤是至关重要的, 因为它增加了在 405 nm 的吸收浓度, 可能是通过消除酶反应过程中产生的任何可能的…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我们感谢威廉·雷尼·哈珀学院和伊利诺伊大学提供的进行这些实验的设施。我们还感谢麦格劳·希尔基金会的慷慨支持。
Materials
| Agar | VWR | 9002-18-0 | |
| Eppendorf Centrifuge | Thomas Scientific | 5810 | |
| Gluose | VWR | 50-99-7 | |
| NaOH pellets | VWR | SS0550-500GR | |
| Para-nitrophenylphosphate (pNPP) | Sigma | P7998-100ML | Typical concentrations of pNPP liquid substrates, often used in enzyme-linked immunesorbent assays (ELISA), range between 10 to 50 mM. Similar to most ready-to-use pNPP liquid substrates like the one used here, the exact pNPP concentration is not disclosed due to its proprietary nature. |
| 10X PBS, pH7.4. 173 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 8 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4 |
Sigma | P3288-1VL | |
| Plate Reader | Biotek | ELx808 | |
| S. aureus | ATCC | ATCC25923 | |
| Tryptic Soy Agar 15g / L TSB | VWR | 9002-18-0 | |
| Tryptic Soy Broth: g/L Pancreatic Digest of Casein………… 15.0 Papaic Digest of Soyben Meal………5.00 Sodium chloride………………………… 3.00 Dextrose…………………………………. 2.50 Dipotassium phosphate………………2.50 |
VWR | 90006-098 | |
| 96 well tissue culture plates | BD | 6902D09 | U shaped bottom |
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