Kolorimetriska analys av alkaliskt fosfatasaktiviteten i S. aureus Biofilm

Summary

I detta manuskript etablerade vi en hög genomströmning metod för att kvantifiera alkaliskt fosfatasaktiviteten i S. aureus biofilm kultur från 96 brunnar vävnadsodling plattan

Abstract

Alkaliskt fosfatas (ALP) är en gemensam enzym uttrycks i både prokaryota och eukaryota celler. Det katalyserar hydrolys av fosfat monoesters från många molekyler vid grundläggande pH och en oumbärlig roll i metabolismen av fosfat. I människor är eukaryota ALP en av de vanligaste enzymatiska signalerna diagnostisera olika sjukdomar, såsom gallstas och rakitis. I S. aureus, ALP upptäcks uteslutande på cellmembranet; det uttrycks också som en sekretoriska form också. Men är lite känt om dess funktion i biofilm bildning.

Syftet med detta manuskript är att utveckla en snabb och tillförlitlig test för att mäta ALP aktivitet i S. aureus biofilm som inte kräver protein isolering. Använder p-nitrofenylfosfat fosfat (pNPP) som substrat, mätte vi ALP aktivitet i S. aureus biofilm bildas i 96 brunnar vävnadsodling plattor. Aktiviteten bygger på bildandet av lösliga reaktionsprodukten mäts av 405 nm absorbans. Hög genomströmning beskaffenhet metoden 96 väl vävnadsodling plattan ger en känslig och reproducerbar metod för ALP aktivitet analyser. Samma experimentell uppsättning kan även utökas för att mäta andra extracellulära molekylära markörer relaterade till biofilm bildning.

Introduction

Alkaliskt fosfatas (ALP) uttrycks ubiquitously i både prokaryota och eukaryota celler¹. Det kan katalyserar hydrolys av monofosfat från olika molekyler såsom nukleotider, proteiner, alkaloider, fosfatestrar och anhydrider av fosforsyra. Människor förekommer eukaryota ALP i många vävnader inklusive levern, skelettet, tarmen och moderkakan². Det spelar viktiga roller i protein fosforylering, celltillväxt, apoptos, stamceller processer samt normal mineralisering av skelettet. Eukaryota ALP är också en nyckel serum indikator för förekomst av sjukdomar i skelettet, levern och andra vävnader/organ när förhöjda^3,4.

Prokaryota ALP har upptäckts i en mängd olika bakterieceller, inklusive E. coli⁵, S. aureus^6,7 och vissa gemensamma våmmen bakterier i jordar⁸. Bakteriella ALP aktivitet har använts som en biosensor för detektion av bekämpningsmedel, tungmetaller⁹ och bakteriell kontamination¹⁰. Det konstitutiva uttrycket för ALP har använts att identifiera stafylokocker¹¹ och att skilja Serratia från Enterobacter¹². Det föreslås vidare att konstituerande ALP produktion är korrelerad med patogenicitet stafylokocker¹³. Även om ALP har studerats i olika inställningar^3,4, ännu rapporteras lite för dess aktivitet och funktion i biofilmer kulturer.

En biofilm har dokumenterats för att har ett olikt fungerande bakteriell liv jämfört med dess fri-uppehället bakteriecell motsvarighet¹⁴. I S. aureus, har bildandet av biofilm identifierats i en mängd olika kliniska tillstånd och konton för antibiotikaresistens och kronisk inflammation^15,16. Många molekyler hade rapporterats i en biofilm matris såsom polysackarider, proteiner, nukleinsyror och lipider, men mekanismen av biofilm bildning är inte fullt ut förstått¹⁴. För att förstå rollen av ALP i biofilm bildning, vi odlade S. aureus biofilmer i 96 väl vävnadsodling plattor och mätt aktiviteten ALP med para-nitrophenylphosphate (pNPP).

Den molekyl pNPP är redo att använda substrat för ALP och har använts i stor utsträckning att mäta ALP aktivitet^6,17,18. Denna kolorimetriska analys baseras på omvandlingen av para-nitrofenyl fosfat (pNPP) till para-nitrofenol resulterar i en färgad produkt vid 405 nm. Jämfört med andra konventionella ALP-analysen, som agaros gel elektrofores¹⁹, vetegroddar agglutinin (WGA) nederbörd, och WGA-HPLC²⁰, denna analys är mycket specifika, möjliggör känslig, lätt att reproducera, och de flesta viktigare, hög genomströmning.

Protocol

1. medium förberedelse Förbereda 1 L av Tryptic Soy buljong (TSB): I 1 L destillerat vatten, tillsätt 15 g bukspottskörteln digest kasein, 5 g papaic sammandrag av sojamjöl, 3 g natriumklorid, 2,5 g dextros och 2,5 g dikaliumvätefosfat fosfat. Sterilisera före användning. För Tryptic Soy Agar (TSA), tillsätt 15 g agar till 1 L av TSB, autoklav. Sedan låt den svalna ner till rumstemperatur. Nästa, häll i förhållandet 20 mL per petriskål (100 x 15 mm). Biofilm odlingssubstratet…

Representative Results

Figur 1 visar representativa resultat av ALP aktivitet från biofilm kulturer av S. aureus i 96 väl vävnadsodling plattor. 75 μL av kommersiellt tillgängliga pNPP lösning lades till varje brunn och inkuberas vid rumstemperatur. Efter inkubation i olika tider (0 min, 15 min, 30 min, 45 min, 60 min och 75 min, respektive) 75 μl 5 M NaOH lades till för att stoppa reaktionen. Produkten mättes sedan i en 96 väl Plattläsare vid 405 nm. Varje tidp…

Discussion

I vår analys använde vi pNPP som ALP substratet. Detta är en fungerande lösning utformad för ELISA och ingen utspädning behövs. Efter hydrolys av ALP, en gul produkt utvecklar och kan mätas vid 405 nm. I slutet av den enzymatiska reaktionen, vi kortfattat centrifugeras 96 väl plattan och överförs supernatanten till en färsk 96 väl platta att mäta absorbansen med plattan läsaren. Vi fann att detta extra centrifugering steg är kritisk, eftersom den ökar konsekvensen av absorbansen vid 405 nm, förmodligen …

Materials

Agar	VWR	9002-18-0
Eppendorf Centrifuge	Thomas Scientific	5810
Gluose	VWR	50-99-7
NaOH pellets	VWR	SS0550-500GR
Para-nitrophenylphosphate (pNPP)	Sigma	P7998-100ML	Typical concentrations of pNPP liquid substrates, often used in enzyme-linked immunesorbent assays (ELISA), range between 10 to 50 mM. Similar to most ready-to-use pNPP liquid substrates like the one used here, the exact pNPP concentration is not disclosed due to its proprietary nature.
10X PBS, pH7.4. 173 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 8 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4	Sigma	P3288-1VL
Plate Reader	Biotek	ELx808
S. aureus	ATCC	ATCC25923
Tryptic Soy Agar       15g / L TSB	VWR	9002-18-0
Tryptic Soy Broth:      g/L Pancreatic Digest of Casein………… 15.0 Papaic Digest of Soyben Meal………5.00 Sodium chloride………………………… 3.00 Dextrose………………………………….  2.50 Dipotassium phosphate………………2.50	VWR	90006-098
96 well tissue culture plates	BD	6902D09	U shaped bottom