Wir beschreiben ein umfassendes und praxisnahes Protokoll für die Fluoreszenz-Wiederherstellung nach Immunofluoreszenz Experimente mit Zellen Leben. Obwohl das Protokoll verwendet wurde, um die Mobilität der gelb fluoreszierende Protein-Tags p62 in Aggresome-induzierten Strukturen zu messen, kann es zu einer Vielzahl von Mikroskopiesysteme und fluoreszierende Proteine angewendet werden.
Fluoreszenz-Erholung nach Immunofluoreszenz (FRAP) ist eine Mikroskopie-Technik, die verwendet werden kann, um Protein Mobilität in lebenden Zellen zu quantifizieren. In einem typischen FRAP-Experiment wird durch wiederholte Bildgebung mit niedriger Intensität Laserlicht stationären Fluoreszenz beobachtet. Anschließend sind die fluoreszierenden Molekülen über kurze hochintensive Laser Lichteinwirkung rasch und irreversibel beeinträchtigt. Informationen über Protein Mobilität ergibt sich durch die Überwachung der Erholung der Fluoreszenz. Wir gewohnt FRAP, um die Mobilität der p62 in Aggresome-induzierten Strukturen (ALIS) in murinen Makrophagen nach Stimulation mit Lipopolysaccharid (LPS) zu bestimmen. Da viele vorhandene FRAP Protokolle entweder unvollständig oder komplex sind, war unser Ziel, eine umfassende, praktische und einfache Schritt für Schritt Protokoll für FRAP Experimente mit lebenden Zellen zur Verfügung zu stellen. Hier beschreiben wir RAW264.7 Makrophagen Transfektion mit gelb fluoreszierende Protein-p62 (YFP-p62), Induktion von ALIS indem man die Zellen LPS und eine schrittweise Methode für das Sammeln von prebleach und postbleach FRAP Bilder und Datenanalyse. Schließlich diskutieren wir wichtige Faktoren zu berücksichtigen, wenn Sie eine FRAP-Experiment durchführen.
Fluoreszenz-Recovery nach Immunofluoreszenz (FRAP) eine Mikroskopie-Technik, die verwendet werden können ist, zu quantifizieren Proteindynamik Live Zellen1,2. Die Popularität der FRAP aufgrund der weit verbreiteten kommerziellen Verfügbarkeit von Laser-scanning-konfokale Mikroskope mit hoher Auflösung, Geschwindigkeit und Empfindlichkeit zugenommen hat, und ein “Regenbogen” von genetisch codiert fluoreszierende Proteine, wie z.B. Grün fluoreszierend Protein (GFP) und gelb fluoreszierenden Proteins (YFP)3. Genetisch codierte fluoreszierende Proteine sind an ein Protein des Interesses für die subzelluläre Lokalisation des Proteins des Interesses ermöglichen fusioniert. In einem typischen FRAP-Experiment wird die Steady-State Fluoreszenz in einer Übernahme Region of Interest (ROI) innerhalb einer Zelle über wiederholte Darstellung der diese Rendite mit Laserlicht niedriger Intensität beobachtet. Anschließend sind die fluoreszierenden Moleküle in eine vordefinierte Teilmenge des Erwerbs ROI, nachstehend das Bleichmittel ROI, durch kurze hochintensive Laser Lichteinwirkung rasch und irreversibel beeinträchtigt. Als neue ungebleicht Proteine gebleichten Proteine im Laufe der Zeit wieder aufzufüllen, informiert die Geschwindigkeit und die Intensität der Fluoreszenz-Erholung in der Bleiche ROI über Protein Mobilität (Abbildung 1)4.
Unser Interesse an der Ermittlung der Mobilität von Ubiquitin bindende Protein p62 (auch bekannt als Sequestosome-1) in Aggresome-induzierten Strukturen (ALIS) in murinen RAW264.7 Makrophagen nach Stimulation mit Lipopolysaccharid (LPS) uns zur Überprüfung der FRAP führte Literatur. Leider sind viele der vorhandenen FRAP Protokolle unvollständig oder übermäßig komplex5,6,7,8,9. Einige bieten keine detaillierte Informationen über die Lasereinstellungen, Strahl Weg Konfiguration und Bild Erwerb Parameter5,6,7,8,9. Andere wichtige Details zur Datenanalyse, z. B. wie man das Problem der Bleichmittel ROI Drift6,9 oder wie wichtig Wiederherstellungsparameter, einschließlich der mobilen Bruchteil (M-f), unbeweglich Bruchteil berechnen weggelassen (Ichf), und Halbzeit-Wiederherstellung (t½)5,7. Umgekehrt, andere zuviel Schwerpunkt auf komplexen mathematischen Formeln zur Berechnung von M-f, ichfund t1/25,6,8,9. Somit ist unser Ziel, eine umfassende, praktische und einfache Schritt für Schritt Protokoll für FRAP Experimente mit lebenden Zellen bieten.
Wir bieten eine umfassende, praktische und einfache Schritt für Schritt Protokoll für FRAP Experimente mit lebenden Zellen. Hier das Protokoll wurde verwendet, um die Mobilität der YFP-p62 in ALIS in RAW264.7 Makrophagen zu messen, aber es kann auf viele der Laserscanning confocal Mikroskop-Systeme angewendet werden und genetisch codierte fluoreszierende Proteine, die jetzt verfügbar sind. Für jedes Mikroskopie-System sind Pilotversuchen entscheidend für die Bestimmung der optimalen FRAP-Parameter, einschließlich Erwerb, Bleichmittel und Kontrolle ROI Größen Laserintensität für Immunofluoreszenz und prebleach und postbleach Bildaufnahme. Es ist sinnvoll, die optimale FRAP-Parameter für jede genetisch codierte fluoreszierende Protein und Zelle Linie abweichen zu erwarten.
Wichtige Faktoren zu berücksichtigen, wenn Durchführung eines Experiments FRAP umfassen (a) erreichen geeignet bleichen Tiefe, (b) die Verwendung von einem kurzen bleichen Schritt (c) so dass genügend Zeit Postbleach zu beobachten, die vollständige Wiederherstellungsfunktion, (d) Immunofluoreszenz Effizienz, (e). Zytotoxizität mit wiederholten FRAP und (f) die Aufnahme eines Steuerelements für Fluoreszenz-Verlust wegen wiederholter Bildgebung. Es wird empfohlen, Tiefe, Bleichmittel, die gemäß der in Abschnitt 3.3.1 bereitgestellten Gleichung berechnet werden kann, ≥9013Jahre alt sein. Als Bleichmittel Tiefe ist < 90, der Grad der postbleach Fluoreszenz Erholung wird unterschätzt werden, und die Werte von IfMfund t1/2 werden falsch. Obwohl die Dauer und Intensität der Laserpulse Bleichmittel-induzierende zwischen FRAP Experimente variieren, ist es wichtig, dass die Immunofluoreszenz Schritt kurz und deutlich schneller als der Fluoreszenz-Recovery-Funktion. Wenn es nicht ist, könnte eine erhebliche Menge an Fluoreszenz Erholung während der Bleiche Schritt auftreten. Mit einer langen Bleichmittel, Fluoreszenz Erholung während der Bleiche Schritt nicht gemessen werden, und es würde führen zu Fehlmessungen von If, M,f, undt1/2. Darüber hinaus, um korrekte Werte zu erhalten für If, M,f, undt1/2, mit dem ROI beachtet werden postbleach bis die Fluoreszenz in der Bleiche ROI ein Plateau erreicht hat. Zum Beispiel in unseren Experimenten FRAP gab es keinen Unterschied zwischen dem ichf, M,fund t1/2 Werte wenn wir YFP-p62 Fluoreszenz in der Bleiche ROI 32,2 min postbleach beobachtet gegenüber wenn wir YFP-p62, in der Bleiche ROI beobachtet für 15,1 min Postbleach; So schlossen wir, dass die Recovery-Funktion ein Plateau bei 15,1 min postbleach12erreicht. Im Hinblick auf Immunofluoreszenz Effizienz erhöht Immunofluoreszenz mit dem Quadrat der optische Zoom Faktor14. Somit ist die Verwendung von hohen optischen Zoom-Objektive ist günstig für schnelle Immunofluoreszenz aber unerwünschte Immunofluoreszenz während der Akquisition führen kann; Letztere können berücksichtigt werden durch bildgebende ein Steuerelement ROI. Wiederholte Immunofluoreszenz soll vermieden werden, da es zu der Generation von zytotoxisch reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) führen kann. Jedoch der Grad der ROS-Generation aufgrund der Exposition gegenüber einem Hochleistungs Laser ist geringer bei genetisch codierte fluoreszierende Proteine als chemische Fluorophore (z. B. fluoreszierende Antikörper)15, und der ROS erzeugt eher reagieren innerhalb der genetisch codierten fluoreszierenden Proteins als mit anderen Molekülen in der Zelle4. Neben der erhöhten Wahrscheinlichkeit der Erzeugung von zytotoxischen ROS soll wiederholte Immunofluoreszenz vermieden werden, da es schwer zu kontrollieren ist. Schließlich obwohl niedrige Laser Übertragung verwendet wird, um alle nicht-Bleichmittel Bilder zu erwerben, wird einige Immunofluoreszenz unweigerlich auftreten, muss kontrolliert werden. Mögliche Kontrollen dafür gehören Überwachung Fluoreszenz in einem Steuerelement ROI innerhalb der Erwerb ROI, Erlangung der Kontrolle Bilder in eine Nachbarzelle ungebleicht und Kontrolle experimentieren mit identischen Einstellungen für die in der Immunofluoreszenz-Experimente, aber ohne das Immunofluoreszenz-Ereignis.
The authors have nothing to disclose.
Wir danken Dr. Seth Robia Loyola University Chicago für seine wertvollen Anmerkungen zu dieser Handschrift. Diese Arbeit wurde von NIH Grant 1R01NS073967-01A1 zu Joanna C. Bakowska unterstützt.
Dulbecco's Modified Eagle Medium | Hyclone | SH30022.01 | High Glucose (4.5 g/L) |
Fetal bovine serum | Gemini Bio-Products | 100-106 | |
Glass bottom dishes | MatTek | P35G-1.5-14-C | 35-mm |
Image J software | National Institutes of Health | N.A. | |
Lipopolysaccharide (LPS) | Sigma | L4391 | |
Nocodazole | Sigma | M1404 | |
Penicillin-streptomycin solution | Corning | 30-002-Cl | 100× |
Plan-Apochromat 63×/1.40 oil objective | Carl Zeiss MicroImaging, Inc | 4407629904000000 | |
Polyethylenimine (PEI) | Polysciences | 23966-1 | linear (MW 25,000) |
RAW 264.7 murine macrophages | ATCC | TIB-71 | |
Zeiss confocal microscope | Carl Zeiss MicroImaging, Inc | LSM 510 |