Lipídico rápido gota protocolo de aislamiento utilizando un Kit de aislamiento de organelas bien establecidas
Summary
Este Protocolo establece un método novedoso de aislamiento de gotas de lípido y purificación de hígado de ratón, usando un kit de aislamiento de retículo endoplásmico bien establecida.
Abstract
Gotitas del lípido (LDs) son bioactivos organelos encontrados el citosol de la mayoría eukaryotic y algunas células procariotas. LDs están compuestos de lípidos neutros encajonados por una monocapa de fosfolípidos y proteínas. Lípidos de LD hepáticos, tales como ceramidas y proteínas están implicados en varias enfermedades que causan esteatosis hepática. Aunque los métodos anteriores se han establecido para el aislamiento de LD, requieren una tiempo preparación de reactivos y no están diseñados para el aislamiento de varios compartimentos subcelulares. Se intentó establecer un nuevo protocolo para permitir el aislamiento de LDs, retículo endoplásmico (ER) y lisosomas de hígado de ratón.
Además, todos los reactivos utilizados en el protocolo que presentamos están disponibles en el mercado y requieren de una preparación reactivo mínimo sin sacrificar la pureza del LD. Aquí presentamos datos que comparan este nuevo protocolo un protocolo gradiente de sacarosa estándar, demostrando producción, morfología y pureza comparable. Además, podemos aislar ER y lisosomas utilizando la misma muestra, proporcionando visión detallada de la formación y el flujo intracelular de lípidos y sus proteínas asociadas.
Introduction
LDs son bioactivos organelos encontrados el citosol de las células eucariotas más y algunas células procariotas1,2,3. El núcleo de la LD está compuesto por lípidos neutros como los triglicéridos (TG) y ésteres de colesterol. También contienen ceramidas, lípidos bioactivos en de4,de vías de señalización celular5. LDs están rodeados por una monocapa de fosfolípidos y recubiertas de proteínas, incluyendo la perilipin proteínas perilipin 2 (PLIN2) y 3 (PLIN3)1,5,6. También están presentes las enzimas lipogénicos, lipasas y proteínas de la membrana la trata de personas que han sido vinculadas a varias enfermedades steatotic hepáticas, incluyendo enfermedad del hígado graso no alcohólico, enfermedad hepática alcohólica y la hepatitis C3,5 ,6,7,8,9,10.
LDs se cree que la forma de la membrana externa de la ER y contienen TG recién sintetizada de ácidos grasos libres derivados de ER11. Sin embargo, sigue siendo desconocido si los lípidos combinados bud, permanecer conectados, o son suprimidos de la ER6,11, haciendo el aislamiento de LDs de ER técnicamente difícil. Ácidos grasos libres pueden ser liberados del Sud por la acción de las lipasas superficie para proporcionar para la producción de energía o la síntesis de la membrana. Además, LDs pueden ser degradados a través de lipophagy como un mecanismo regulador y para producir ácidos grasos libres12.
Además del ER y lisosomas, hay otros organelos, como mitocondrias, peroxisomas, endosomas y la membrana plasmática, que se encuentran en estrecha asociación de LDs11. Esta poligamia apretada dificulta realizar una extracción pura de LD. Sin embargo, innata de baja densidad lípidos neutros puede ser aprovechada mediante centrifugación5.
Tradicionalmente, LDs han aislado con una sacarosa densidad gradiente1,5,13. Sin embargo, estos métodos no han sido diseñados para aislar otros organelos. Además, necesitan el tiempo preparación de los reactivos. Este protocolo adapta un aislamiento comercial de ER kit (véase la Tabla de materiales) para permitir el aislamiento de LD. Usamos el tampón de extracción proporcionado por el kit, agregar un paso de aislamiento de LD. Además, el protocolo también puede utilizarse para ER y aislamiento lisosomal utilizando las mismas muestras, lo que permite una imagen más completa del ciclo de vida de LDs. Para validar este nuevo método, ensayo de rendimiento de LD, morfología, tamaño y pureza. Se comparan los resultados presentados aquí a los obtenidos con un protocolo ampliamente utilizado utilizando un gradiente de sacarosa para el aislamiento de LD.
Utilizamos un 10 a 12-semanas de edad, 20 g hembra C57BL/6 ratón ayunó durante 16 h (eliminación de alimentos en 17:00 para un tiempo de aislamiento de LD de 9:00) con acceso libre al agua. El rendimiento típico de TG es 0.6 mg/g hígado y para la proteína del LD, es hígado de 0,25 mg/g. Esto proporciona suficiente material para ~ 10 immunoblots por SDS PAGE. El protocolo a continuación de los datos de los reactivos usados y un protocolo adecuado para un hígado solo 1 g. El protocolo de aislamiento gradiente de sacarosa es adaptado de Sato14 y15de Wu.
Protocol
Representative Results
Discussion
Biología de LD hepático es cada vez más reconocida como un regulador crítico de la fisiología hepatocelular en salud y enfermedad. Como organelos de buena fe, LDs son dinámicos, interactuar con otras estructuras celulares y contienen dentro de los componentes bio-activos involucrados en la homeostasis de lípidos y glucosa. El gradiente de la sucrosa se utiliza habitualmente para el aislamiento de LD y permite a los investigadores a estudiar la estructura de LD, pero requiere hacer numerosas reservas. Hemos demostr…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a la familia de Abramson Cancer Research Institute. Este trabajo es apoyado por las subvenciones siguientes: NIAAA/NIH R01 AA026302-01, NIH/NIAAA K08-AA021424, la Fundación Robert Wood Johnson, Harold Amos Facultad desarrollo Premio médicos, 7158, IDOM RDC piloto Premio P30 DK019525 (R.M.C.); NIH/NIAAA F32-AA024347 (J.C.). Este trabajo fue financiado en parte por el NIH P30-DK050306 y sus instalaciones de la base (Patología Molecular y Imaging Core, Biología Molecular del Gene expresión núcleo y base de la cultura de célula) y su piloto programa de subvenciones. El contenido es responsabilidad exclusiva de los autores y no representan necesariamente las opiniones oficiales de los institutos nacionales de salud.
Materials
| BioExpress Vortex Mixer | GeneMate | S-3200-1 | Vortex Mixer |
| Centrifuge 54242 R | Eppendorf | 54242 R | Refrigerated Counter Microcentrifuge Rotor: FA-45-24-11 |
| Centrifuge Sorvall RC6 + | Thermo Scientific | RC6+ | Refrigerated High Speed Centrifuge Rotor: F21S-8x50y |
| Centrifuge Sorvall Legend RT+ | Thermo Scientific | Legend RT+ | Refrigerated High Capacity Centrifuge Rotor: 75006445 Bucket: 75006441 |
| cOmplete Protease Inhibitor Cocktail | Sigma Aldrich | 04 693 116 001 | Protease Inhibitor Tablets |
| Diagenode Bioruptur UCD-200 | Diagenode | UCD-200 | Sonication System |
| Dounce Tissue Grinder (45 mL) | Wheaton | 357546 | Use Loose pestle |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (1x) | Corning | 21-031-CM | |
| Endoplasmic Reticulum Isolation Kit | Sigma Aldrich | ER0100 | For ER kit Extraction: Contains: Isotonic Extraction Buffer 5X 100 mL Hypotonic Extraction Buffer 10 mL Calcium chloride, 2.5 M solution 5 mL OptiPrep Density Gradient Medium 100 mL Blunt Nosed Needle 1 ea. |
| External light source for flourescent excitation | Leica | Leica EL6000 | |
| Hydrochloric acid | Sigma Aldrich | H1758 | Hydrochloric Acid |
| ImageJ | Image Analysis Software | ||
| Inverted Modulating Contrast Microscope | Leica | Leica DM IRB | |
| Lysosome Enrichment Kit for Tissues and Cultured Cells | Thermo Fisher Scientific | 89839 | For Lysosome Isolation |
| Microscope Camera | Qimaging | QICAM fast 1394 | |
| Optima XL-100K Ultracentrifuge | Beckman-Coulter | XL-100K | Ultracentrifuge Rotor: SW41Ti |
| Pasteur Pipettes | Fisher Scientific | 22-042817 | |
| Petri Dish 5 cm | Fisher Scientific | FB0875713A | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | 23225 | |
| PhosSTOP | Sigma Aldrich | 04 906 845 001 | Phosphatase Inhibior Tablets |
| Sterile Surgical Blade #10 | Pioneer | S2646 | |
| Sucrose | Fisher Scientific | S5-500 | Crystalline/Certified ACS |
| Triglyceride Liquicolor Kit | Stanbio | 2200-225 | Colorimetric Triglyceride kit |
| Tris Base | Fisher Scientific | BP152-1 | For TE buffer |
| Triton X-100 | Fisher BioReagents | BP151-100 | 5%, Polyethylene glycol p-(1,1,3,3-tetramethylbutyl)-phenyl ether, Protein Lysis Reagent |
| UltraPure EDTA (0.5M, pH 8.0) | Thermo Fisher Scientific | 15575-038 | For TE buffer |
Riferimenti
- Brasaemle, D. L., Wolins, N. E. Isolation of Lipid Droplets from Cells by Density Gradient Centrifugation. Current Protocols in Cell Biology. 72, (2016).
- Ding, Y., et al. Isolating lipid droplets from multiple species. Nature Protocols. 8 (1), 43-51 (2013).
- Gao, Q., Goodman, J. M. The lipid droplet-a well-connected organelle. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 3, 49 (2015).
- Correnti, J. M., et al. Ethanol and C2 ceramide activate fatty acid oxidation in human hepatoma cells. Scientific Reports. 8 (1), 12923 (2018).
- Williams, B., et al. A novel role for ceramide synthase 6 in mouse and human alcoholic steatosis. FASEB Journal. 32 (1), 130-142 (2018).
- Carr, R. M., Ahima, R. S. Pathophysiology of lipid droplet proteins in liver diseases. Experimental Cell Research. 340 (2), 187-192 (2016).
- Carr, R. M., et al. Perilipin Staining Distinguishes Between Steatosis and Nonalcoholic. Steatohepatitis in Adults and Children. Clinical Gastroenterology and Hepatology. 15 (1), 145-147 (2017).
- Carr, R. M., et al. Reduction of TIP47 improves hepatic steatosis and glucose homeostasis in mice. American Journal of Physiology: Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 302 (8), R996-R1003 (2012).
- Carr, R. M., Peralta, G., Yin, X., Ahima, R. S. Absence of perilipin 2 prevents hepatic steatosis, glucose intolerance and ceramide accumulation in alcohol-fed mice. PLoS One. 9 (5), e97118 (2014).
- Tsai, T. H., et al. The constitutive lipid droplet protein PLIN2 regulates autophagy in liver. Autophagy. 13 (7), 1130-1144 (2017).
- Guo, Y., Cordes, K. R., Farese, R. V., Walther, T. C. Lipid droplets at a glance. Journal of Cell Science. 122 (Pt 6), 749-752 (2009).
- Liu, K., Czaja, M. J. Regulation of lipid stores and metabolism by lipophagy. Cell Death and Differentiation. 20 (1), 3-11 (2013).
- Mannik, J., Meyers, A., Dalhaimer, P. Isolation of cellular lipid droplets: two purification techniques starting from yeast cells and human placentas. Journal of Visualized Experiments. (86), e509814 (2014).
- Sato, S., et al. Proteomic profiling of lipid droplet proteins in hepatoma cell lines expressing hepatitis C virus core protein. Journal of Biochemistry. 139 (5), 921-930 (2006).
- Wu, C. C., Howell, K. E., Neville, M. C., Yates, J. R., McManaman, J. L. Proteomics reveal a link between the endoplasmic reticulum and lipid secretory mechanisms in mammary epithelial cells. Electrophoresis. 21 (16), 3470-3482 (2000).
- Zhang, S., et al. Morphologically and Functionally Distinct Lipid Droplet Subpopulations. Scientific Reports. 6, 29539 (2016).
