Snabb Lipid Droplet isolering protokoll använder en väletablerad organell isolering Kit
Summary
Detta protokoll fastställs en ny metod för lipid droplet isolering och rening från mus lever, med en väletablerad endoplasmatiska retiklet isolering kit.
Abstract
Lipid droppar (LDs) är bioaktiva organeller som finns i cytosolen i de flesta eukaryota och vissa prokaryota celler. LDs består av neutrala lipider inneslutna av en enskiktslager av fosfolipider och proteiner. Nedsatt LD lipider, till exempel ceramider och proteiner är inblandad i flera av de sjukdomar som orsakar leversteatos. Även om föregående metoder har fastställts för LD isolering, de kräver en tidskrävande beredning av reagens och är inte avsedda för isolering av flera subcellulär fack. Vi försökt att etablera ett nytt protokoll om du vill aktivera isolering av LDs, endoplasmatiska nätverket (ER) och lysosomer från en enkel mus lever.
Ytterligare, alla reagenser som används i det protokoll som presenteras här är kommersiellt tillgängliga och kräver minimal REAGENSBEREDNING utan att offra LD renhet. Här presenterar vi data som jämför detta nya protokoll till en standard sackaros gradient protokoll, visar jämförbara renhet, morfologi och avkastning. Dessutom kan vi isolera ER och lysosomer använder samma prov, som ger detaljerad insikt i bildandet och intracellulära flux av lipider och deras associerade proteiner.
Introduction
LDs är bioaktiva organeller som finns i cytosolen av de flesta eukaryota celler och vissa prokaryota celler1,2,3. LD kärnan består av neutrala lipider som triglycerider (TG) och kolesterol estrar. De innehåller också ceramider, bioaktiva lipider inblandade i cellulär signalering vägar4,5. LDs är omgiven av en fosfolipid enskiktslager och belagda med proteiner, inklusive den perilipin proteiner perilipin 2 (PLIN2) och 3 (PLIN3)1,5,6. Också närvarande är lipogenic enzymer, lipaser och människohandel membranproteiner som har kopplats till flera nedsatt steatotic sjukdomar, inklusive alkoholfria fettlever, alkoholhaltiga leversjukdom och hepatit C3,5 ,6,7,8,9,10.
LDs är tänkt att bilda från det yttre membranet av ER och innehåller nya syntetiserade TG från ER-derived fria fettsyror11. Det är dock fortfarande okänt om de poolade lipider bud, vara ansluten eller är censurerade från ER6,11, att göra isoleringen av LDs fri från ER tekniskt utmanande. Fria fettsyror kan befrias från LDs genom inverkan av surface lipaser för energiproduktion eller membran syntes. LDs kan dessutom brytas via lipophagy som en reglerande mekanism och att producera fria fettsyror12.
Förutom ER och lysosomer, finns det andra organeller — såsom mitokondrier, endosomes, peroxisomes och plasmamembranet — som finns inom nära sammanslutning av LDs11. Denna snäva månggifte gör det svårt att utföra en ren LD-extraktion. Dock kan neutrala lipider medfödd låg densitet utnyttjas via centrifugering5.
Traditionellt, att LDs har isolerats med en sackaros täthet lutning1,5,13. Dessa metoder har dock inte utformats för att isolera andra organeller. Dessutom kräver de tidskrävande beredning av reagens. Detta protokoll anpassar en kommersiellt tillgänglig ER isolering kit (se Tabell för material) för att möjliggöra LD isolering. Vi använder utvinning bufferten som tillhandahålls av satsen, att lägga till ett LD isolering steg. Dessutom kan protokollet också användas för ER och lysosomala isolering använder samma proverna, vilket möjliggör en mer heltäckande bild av LDs livscykel. För att validera denna nya metod, assay vi LD avkastning, morfologi, storlek och renhet. Vi jämför de resultat som presenteras här som erhålls med ett allmänt använda protokoll som utnyttjar en sackaros gradient i LD isolering.
Vi använde en 10 – till 12-vecka-gammal, 20 g kvinnliga C57BL/6 mus fastar 16 h (mat borttagning vid 17.00 9.00 LD isolering tid) med fri tillgång till vatten. Den typiska avkastningen för TG är 0,6 mg/g lever, och för LD protein, det är 0,25 mg/g lever. Detta ger tillräckligt med material för ~ 10 immunoblots av SDS. Protokollet nedan beskriver de reagens som används och ett protokoll som är lämplig för en enda 1 g lever. Sackaros gradient isolering protokollet är anpassad från Sato14 och Wu15.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nedsatt LD biologi är alltmer erkänns som en kritisk regulator av hepatocellulär fysiologi i hälsa och sjukdom. Bona fide organeller, LDs är dynamiska, interagera med andra cellulära strukturer samt innehålla inom dem bioaktiva komponenter inblandade i både lipider och glukos homeostas. Toningen som sackaros används rutinmässigt för LD isolering och möjliggör utredarna att studera LD struktur, men det kräver dem att göra ett flertal buffertar. Vi har visat att användningen av ett kommersiellt tillgänglig…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar den Abramson familj Cancer Research Institute. Detta arbete stöds av följande bidrag: NIH/NIAAA R01 AA026302-01, NIH/NIAAA K08-AA021424, Robert Wood Johnson Foundation, Harold Amos medicinska fakulteten Development Award, 7158, IDOM DRC Pilot Award P30 DK019525 (R.M.C.); NIH/NIAAA F32-AA024347 (JC). Detta arbete var stöds delvis av NIH P30-DK050306 och dess corefaciliteter (molekylär patologi och Imaging Core, molekylärbiologi/Gene Expression Core och cellen kultur kärnar ur) och dess pilot bevilja program. Innehållet ansvarar enbart för författarna och representerar inte nödvändigtvis officiella ståndpunkter av National Institutes of Health.
Materials
| BioExpress Vortex Mixer | GeneMate | S-3200-1 | Vortex Mixer |
| Centrifuge 54242 R | Eppendorf | 54242 R | Refrigerated Counter Microcentrifuge Rotor: FA-45-24-11 |
| Centrifuge Sorvall RC6 + | Thermo Scientific | RC6+ | Refrigerated High Speed Centrifuge Rotor: F21S-8x50y |
| Centrifuge Sorvall Legend RT+ | Thermo Scientific | Legend RT+ | Refrigerated High Capacity Centrifuge Rotor: 75006445 Bucket: 75006441 |
| cOmplete Protease Inhibitor Cocktail | Sigma Aldrich | 04 693 116 001 | Protease Inhibitor Tablets |
| Diagenode Bioruptur UCD-200 | Diagenode | UCD-200 | Sonication System |
| Dounce Tissue Grinder (45 mL) | Wheaton | 357546 | Use Loose pestle |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (1x) | Corning | 21-031-CM | |
| Endoplasmic Reticulum Isolation Kit | Sigma Aldrich | ER0100 | For ER kit Extraction: Contains: Isotonic Extraction Buffer 5X 100 mL Hypotonic Extraction Buffer 10 mL Calcium chloride, 2.5 M solution 5 mL OptiPrep Density Gradient Medium 100 mL Blunt Nosed Needle 1 ea. |
| External light source for flourescent excitation | Leica | Leica EL6000 | |
| Hydrochloric acid | Sigma Aldrich | H1758 | Hydrochloric Acid |
| ImageJ | Image Analysis Software | ||
| Inverted Modulating Contrast Microscope | Leica | Leica DM IRB | |
| Lysosome Enrichment Kit for Tissues and Cultured Cells | Thermo Fisher Scientific | 89839 | For Lysosome Isolation |
| Microscope Camera | Qimaging | QICAM fast 1394 | |
| Optima XL-100K Ultracentrifuge | Beckman-Coulter | XL-100K | Ultracentrifuge Rotor: SW41Ti |
| Pasteur Pipettes | Fisher Scientific | 22-042817 | |
| Petri Dish 5 cm | Fisher Scientific | FB0875713A | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | 23225 | |
| PhosSTOP | Sigma Aldrich | 04 906 845 001 | Phosphatase Inhibior Tablets |
| Sterile Surgical Blade #10 | Pioneer | S2646 | |
| Sucrose | Fisher Scientific | S5-500 | Crystalline/Certified ACS |
| Triglyceride Liquicolor Kit | Stanbio | 2200-225 | Colorimetric Triglyceride kit |
| Tris Base | Fisher Scientific | BP152-1 | For TE buffer |
| Triton X-100 | Fisher BioReagents | BP151-100 | 5%, Polyethylene glycol p-(1,1,3,3-tetramethylbutyl)-phenyl ether, Protein Lysis Reagent |
| UltraPure EDTA (0.5M, pH 8.0) | Thermo Fisher Scientific | 15575-038 | For TE buffer |
Riferimenti
- Brasaemle, D. L., Wolins, N. E. Isolation of Lipid Droplets from Cells by Density Gradient Centrifugation. Current Protocols in Cell Biology. 72, (2016).
- Ding, Y., et al. Isolating lipid droplets from multiple species. Nature Protocols. 8 (1), 43-51 (2013).
- Gao, Q., Goodman, J. M. The lipid droplet-a well-connected organelle. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 3, 49 (2015).
- Correnti, J. M., et al. Ethanol and C2 ceramide activate fatty acid oxidation in human hepatoma cells. Scientific Reports. 8 (1), 12923 (2018).
- Williams, B., et al. A novel role for ceramide synthase 6 in mouse and human alcoholic steatosis. FASEB Journal. 32 (1), 130-142 (2018).
- Carr, R. M., Ahima, R. S. Pathophysiology of lipid droplet proteins in liver diseases. Experimental Cell Research. 340 (2), 187-192 (2016).
- Carr, R. M., et al. Perilipin Staining Distinguishes Between Steatosis and Nonalcoholic. Steatohepatitis in Adults and Children. Clinical Gastroenterology and Hepatology. 15 (1), 145-147 (2017).
- Carr, R. M., et al. Reduction of TIP47 improves hepatic steatosis and glucose homeostasis in mice. American Journal of Physiology: Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 302 (8), R996-R1003 (2012).
- Carr, R. M., Peralta, G., Yin, X., Ahima, R. S. Absence of perilipin 2 prevents hepatic steatosis, glucose intolerance and ceramide accumulation in alcohol-fed mice. PLoS One. 9 (5), e97118 (2014).
- Tsai, T. H., et al. The constitutive lipid droplet protein PLIN2 regulates autophagy in liver. Autophagy. 13 (7), 1130-1144 (2017).
- Guo, Y., Cordes, K. R., Farese, R. V., Walther, T. C. Lipid droplets at a glance. Journal of Cell Science. 122 (Pt 6), 749-752 (2009).
- Liu, K., Czaja, M. J. Regulation of lipid stores and metabolism by lipophagy. Cell Death and Differentiation. 20 (1), 3-11 (2013).
- Mannik, J., Meyers, A., Dalhaimer, P. Isolation of cellular lipid droplets: two purification techniques starting from yeast cells and human placentas. Journal of Visualized Experiments. (86), e509814 (2014).
- Sato, S., et al. Proteomic profiling of lipid droplet proteins in hepatoma cell lines expressing hepatitis C virus core protein. Journal of Biochemistry. 139 (5), 921-930 (2006).
- Wu, C. C., Howell, K. E., Neville, M. C., Yates, J. R., McManaman, J. L. Proteomics reveal a link between the endoplasmic reticulum and lipid secretory mechanisms in mammary epithelial cells. Electrophoresis. 21 (16), 3470-3482 (2000).
- Zhang, S., et al. Morphologically and Functionally Distinct Lipid Droplet Subpopulations. Scientific Reports. 6, 29539 (2016).
