Questo protocollo stabilisce un metodo novello di isolamento della gocciolina del lipido e la purificazione dai fegati del topo, utilizzando un kit di isolamento ben consolidata del reticolo endoplasmatico.
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Articolo metodologico
Protocollo di isolamento gocciolina del lipido rapida utilizzando un Kit di isolamento organello ben consolidate
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
Le goccioline del lipido (LDs) sono organelli bioattivi trovati all'interno del citosol delle più eucariotiche e alcune cellule procariotiche. LDs sono composte di lipidi neutri, racchiusi da un monostrato di fosfolipidi e proteine. Lipidi epatici di LD, come ceramidi e proteine sono implicati in diverse patologie che causano steatosi epatica. Anche se i metodi precedenti sono stati stabiliti per l'isolamento di LD, richiedono una lunga preparazione dei reagenti e non sono progettati per l'isolamento di più compartimenti subcellulari. Abbiamo cercato di stabilire un nuovo protocollo per consentire l'isolamento di LDs, reticolo endoplasmico (ER) e lisosomi da un fegato del mouse.
Ulteriormente, tutti i reagenti utilizzati nel protocollo presentato qui sono commercialmente disponibili e richiedono una preparazione minima reagente senza sacrificare la purezza di LD. Qui presentiamo i dati che confrontano questo nuovo protocollo per un protocollo di gradiente di saccarosio standard, dimostrando la resa, la morfologia e la purezza paragonabile. Inoltre, possiamo isolare ER e lisosomi utilizzando lo stesso esempio, fornendo informazioni dettagliate sulla formazione e flusso intracellulare di lipidi e le proteine associate.
Introduzione
LDs sono organelli bioattivi trovati nel citosol delle cellule eucariotiche più e alcune cellule procariotiche1,2,3. Il nucleo di LD è composto da lipidi neutri come esteri del colesterolo e del trigliceride (TG). Inoltre contengono ceramidi, lipidi bioattivi coinvolti nella segnalazione cellulare vie4,5. LDs sono circondati da un monostrato di fosfolipidi e rivestito con proteine, tra cui la perilipina proteine perilipina 2 (PLIN2) e 3 (PLIN3)1,5,<....
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Protocollo
Tutti gli esperimenti sono stati condotti su un banco di laboratorio con dispositivi di protezione individuale appropriati per livello di biosicurezza 1, compreso un camice da laboratorio, guanti e occhiali di sicurezza. Gli esperimenti sono stati eseguiti secondo i protocolli approvati dal istituzionale Animal Care e uso Committee (IACUC) dell'Università della Pennsylvania. Tutti gli sforzi sono stati fatti per ridurre al minimo il disagio degli animali, e gli animali sono stati trattati con un'assistenza umana.
1. isolamento LD utilizzando un kit di isolamento ER
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Preparazione
Nota: Gli importi elencati sono ....
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Risultati
Abbiamo effettuato l'isolamento di LD con il kit ER su circa 30 topi e confrontato i risultati con quelli che seguono il protocollo di isolamento del saccarosio su circa 40 topi. I risultati segnalati sono tipici per entrambi i protocolli. Topi sono stati tenuti a digiuno durante la notte con libero accesso all'acqua, per aumentare il rendimento di LD. Isolamento di LD utilizzando un gradiente di saccarosio è stato eseguito in parallelo con il kit di ER protocollo di isolamento del LD. Ca.......
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Discussione
Biologia di LD epatica sempre più sta riconoscenda come regolatore critico della fisiologia epatocellulare in salute e malattia. Come buona fede organelli, LDs sono dinamici, interagire con altre strutture cellulari e contengono all'interno dei loro componenti bioattivi coinvolti nell'omeostasi del glucosio e del lipido. Il gradiente di saccarosio è usato ordinariamente per l'isolamento di LD e consente ai ricercatori di studiare la struttura della LD, ma richiede loro di fare numerosi buffer. Abbiamo dimostrato che l'us.......
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Dichiarazioni
Dr. Carr riceve il sostegno alla ricerca da intercettare Pharmaceuticals.
Ringraziamenti
Ringraziamo la famiglia Abramson Cancer Research Institute. Questo lavoro è supportato dalle seguenti concessioni: NIH/NIAAA R01 AA026302-01, NIH/NIAAA K08-AA021424, Robert Wood Johnson Foundation, Harold Amos medica facoltà Development Award, 7158, IDOM DRC Pilot Award P30 DK019525 (r.m.c.); NIH/NIAAA F32-AA024347 (J.C.). Questo lavoro è stato sostenuto in parte da NIH P30-DK050306 e suoi servizi di nucleo (patologia molecolare e di Imaging, biologia molecolare/Gene Expression Core e cella cultura Core) e il suo pilota programma di sussidi. Il contenuto è di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresentano necessariamente il punto di vista ufficiale del Nati....
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| BioExpress Vortex Mixer | GeneMate | S-3200-1 | Centrifuga Vortex Mixer |
| 54242 R | Eppendorf | 54242 R | Refrigerato Counter Microcentrifuge Rotore: FA-45-24-11 |
| Centrifuga Sorvall RC6 + | Thermo Scientific | RC6 + | Centrifuga refrigerata ad alta velocità Rotore: F21S-8x50y |
| Centrifuga Sorvall Legend RT+ | Thermo Scientific | Legend RT+ | Centrifuga refrigerata ad alta capacità Rotore: 75006445 Secchio: 75006441 |
| cOmplete Proteasi Inibitore Cocktail | Sigma Aldrich | 04 693 116 001 | Compresse Inibitore della proteasi |
| Diagenode Bioruptur UCD-200 | Diagenode | UCD-200 | Sistema di sonicazione |
| Dounce Tissue Grinder (45 mL) | Wheaton | 357546 | Use Pestello sciolto |
| Kit di isolamento del reticolo endoplasmatico tamponato con fosfato di Dulbecco (1x) | Corning | 21-031-CM | |
| Sigma Aldrich | ER0100 | Per il kit ER Estrazione: Contiene: Tampone di estrazione isotonica 5X 100 mL Tampone di estrazione ipotonica 10 mL Cloruro di calcio, soluzione 2,5 M 5 mL OptiPrep Gradiente di densità Medium 100 mL Ago dal naso smussato 1 ea. | |
| Sorgente luminosa esterna per eccitazione fluorescente | Leica | Leica EL6000 | |
| Acido cloridrico | Sigma Aldrich | H1758 | Acido cloridrico |
| ImageJ | Software di analisi delle immagini | ||
| Microscopio a contrasto modulante invertito Leica | DM IRB | ||
| per tessuti e cellule in coltura | Thermo Fisher Scientific | 89839 | Per microscopio per isolamento lisosomiale |
| Fotocamera | Qimaging | QICAM fast 1394 | |
| Optima XL-100K Ultracentrifuga | Beckman-Coulter | XL-100K | Ultracentrifuge Rotore: SW41Ti |
| Pasteur Pipette | Fisher Scientific | 22-042817 | |
| Piastra di Petri 5 cm | Fisher Scientific | FB0875713A | |
| Kit per il dosaggio delle proteine BCA Pierce | Thermo Fisher Scientific | 23225 | |
| PhosSTOP | Sigma Aldrich | 04 906 845 001 | Compresse di inibitore della fosfatasi |
| Lama chirurgica sterile #10 | Pioneer | S2646 | |
| Saccarosio | Fisher Scientific | S5-500 | cristallino/certificato ACS |
| Stanbio | 2200-225 | Kit di trigliceridi colorimetrici | |
| Tris Base | Fisher Scientific | BP152-1 | Per tampone TE |
| Triton X-100 | Fisher BioReagents | BP151-100 | 5%, Polietilenglicole p-(1,1,3,3-tetrametilbutil)-fenil etere, Reagente per lisi proteica |
| EDTA ultrapuro (0,5 M, pH 8,0) | Thermo Fisher Scientific | 15575-038 | Per tampone TE |
Riferimenti
- Brasaemle, D. L., Wolins, N. E. Isolation of Lipid Droplets from Cells by Density Gradient Centrifugation. Current Protocols in Cell Biology. 72, (2016).
- Ding, Y., et al. Isolating lipid droplets from multiple species. Nature Protocols. 8
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Ristampe e permessi
