تنقية الكسر الدندي الغنية فيلبوديا
Summary
في هذا البروتوكول، نقدم طريقة لتنقية الكسر الغنية بالفيلوبوديا الدرورية من بنية البروز الشبيهة بالأكواب الفاغوية على الخلايا العصبية الفرسامة المستزرعة من خلال الاستفادة من التقارب المحدد والقوي بين الفيلوبودي الدندرية جزيء التصاق، TLCN، وجزيء مصفوفة خارج الخلية، فيتورينيكستين.
Abstract
فيلبوديا الددرية رقيقة وطويلة على أساس خيوط الأكتين، وأنها تمتد وتتراجع كما لو كان البحث عن محور الهدف. عندما ينشئ الفيلبوديا الددرية الاتصال مع محور الهدف، فإنها تبدأ في النضج في العمود الفقري، مما يؤدي إلى تشكيل متشابك. يتم توطين Telencephalin (TLCN) بوفرة في فيلوبوديا الددرية ويتم استبعاده تدريجيا من العمود الفقري. الإفراط في التعبير عن TLCN في الخلايا العصبية فرس النهر المستزرعة يحفز تشكيل فيلبوديا dendritic. أظهرنا أن التيلجيزين يرتبط بقوة بجزيء مصفوفة خارج الخلية، فيتورينيكستين. فيترونيكستين المغلفة microbeads الناجمة عن تشكيل كأس phagocytic على dendrites الخلايا العصبية. في الكأس phagocytic، TLCN، TLCN ملزمة البروتينات مثل الفسفوريلاتيد إزرين / راديكسين / موسين (فوسفو-ERM)، وF-أكتين تتراكم، مما يشير إلى أن مكونات الكأس phagocytic مماثلة لتلك التي من filopodia dendritic. وهكذا، قمنا بتطوير طريقة لتنقية الكأس phagocytic بدلا من فيلبوديا dendritic. كانت مغلفة الخرز البوليسترين المغناطيسي مع فيتوريتكن، الذي هو موجود بوفرة في وسط الثقافة من الخلايا العصبية فرس النهر والتي تحفز تشكيل كأس phagocytic على dendrites الخلايا العصبية. بعد 24 ساعة من الحضانة، كانت الكؤوس phagocytic الذوبان أقل ما يقال مع المنظفات وجمعها باستخدام فاصل المغناطيس. بعد غسل الخرز، تم تلطخ البروتينات الملزمة وتحليلها من قبل تلطيخ الفضة والنشاف الغربية. في الكسر ملزمة, [تلكن] و [أكتين] كان بوفرة حاضرة. وبالإضافة إلى ذلك، تم توطين العديد من البروتينات التي تم تحديدها من الكسر إلى فيلوبوديا الدندية. وهكذا، أطلقنا على الكسر الملزم كجزء غني بالفيلوبوديا الدندية. توضح هذه المقالة تفاصيل فيما يتعلق بطريقة تنقية للكسر الغنية بالفيلوبوديا dendritic.
Introduction
ويعتقد أن فيلبوديا الددرية هي سلائف العمود الفقري. خيوط أكتين في فيلوبوديا dendritic تنظيمتمديدها والتراجع 1،2،3. بعد الاتصال مع محور، فيلوبوديا dendritic مختارة تبدأ نضجها في العمود الفقري، ويتم تشكيل متشابك4،5. وقد تم تحديد مكونات العمود الفقري من التحليل الشامل للكسور الكثافة المشاركات6،7، في حين أن مكونات filopodia dendritic لا تزال غير معروفة إلى حد كبير. وقد تبين أن telencephalin (TLCN)، ERM، SynGAP، راس، PI3 كيناز، Akt، mTOR، البولو مثل كيناز 2، CaMKII، syndecan-2، paralemin-1، ARF6، وEphB تنظيم تشكيل فيلبوديا dendritic5،8،9 ،10،11، في حين لم يتم تطوير طريقة للتحليل الشامل للجزيئات الموجودة في فيلبوديا dendritic.
يتم التعبير عن TLCN (ICAM-5) على وجه التحديد من قبل الخلايا العصبية الشائكة في الجزء الدماغ الأكثر rostral, وtelencephalon12. TLCN لديها 9 مجالات مثل Ig في منطقتها خارج الخلية، ومنطقة عبر الغشاء، والذيل السيتوبلازمي13. TLCN يربط إلى فيتورينيكستين (VN) وLFA-1 integrin في منطقتها خارج الخلية، إلى presenilin في منطقتها عبر الغشاء، وphospho-ERM وα-actinin في منطقتها السيتوبلازمية5،8،14،15 ،16. TLCN يربط إلى الهيكل السيتوني الأكتين من خلال PHOSPHo-ERM في نصائح من فيلبوديا dendritic وα-actinin في العمود الفقري ومهاوي dendritic8،16.
أظهرنا أن الإفراط في التعبير عن TLCN تعزيز تشكيل فيلبوديا dendritic وحفزت على إعادة العمود الفقري إلى filopodia10. الشكل التأسيسي النشط من ezrin ملزمة لمنطقة السيتوبلازمية TLCN وتعزيز تشكيل فيلبوديا dendritic8. وهكذا، ينظم TLCN تشكيل فيلبوديا الدندرية من خلال البروتينات الملزمة للأكتين. وقد أثبت Esselens وآخرون أن الخرز الصغير الناجم عن تراكم TLCN على الخلايا العصبية المستزرعة17. أظهرنا أن هياكل كأس phagocytic تشكلت على dendrites الخلايا العصبية حول الخرز الصغير المغلفة VN بطريقة تعتمد على TLCN15. مكونات فيلبوديا dendritic مماثلة لتلك التي من كأس phagocytic. من الصعب جمع فيلبوديا dendritic، ولكن من الأسهل نسبيا لجمع الكأس phagocytic باستخدام microbeads المغناطيسي. وهكذا، قمنا بتطوير طريقة لتنقية الكأس phagocytic بدلا من فيلبوديا dendritic18. هنا، ونحن نصف طريقة تنقية للجزء الفيلوبوديا الدندي.
Protocol
Representative Results
Discussion
قمنا بتطوير طريقة تنقية للجزء الغنية بالفيلوبوديا الددرية باستخدام التقارب بين جزيء التصاق الخلية TLCN وبروتين بروتين فيترونيكستين المصفوفة خارج الخلية. بالمقارنة مع كسر PSD، يمكن أن يكون من الممكن تحديد البروتينات متشابك تعمل على متشابك غير ناضجة من الكسر الفيلوبوديا الدندي الغنية. وهكذا…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر شيجيو أوكابي وهيتومي ماتسونو على الثقافة المنخفضة الكثافة للخلايا العصبية في فرس النهر، وماسايوشي ميشينا للفئران التي تعاني من نقص في الـ TLCN، وساكيكو ميتسوي وموموكو شيوزاكي على المساعدة التقنية، وأعضاء مختبر يوشيهارا لإجراء مناقشات مفيدة . وقد حظي هذا العمل بدعم من اللجنة المشتركة بين الأفراد والرابطة. JP20700307, JP22700354, و JP24500392 وMEXT KAKENHI منحة Nos. JP23123525 إلى YF و JP20022046 و JP18H04683 و JP18H05146 إلى YY.
Materials
| 1 M HEPES | Gibco | 15630-080 | |
| 1.7 ml Low Binding MCT | Sorenson BioScience | 39640T | |
| 200 mM L-Glutamine | Gibco | 2530149 | |
| 35-mm plastic cell culture dishes | Corning | 430165 | |
| Anti-actin | Sigma-Aldrich | A-5060 | |
| Anti-alpha-Actinin | Sigma-Aldrich | A-5044 | |
| Anti-alpha-tubulin | Sigma-Aldrich | T-9026 | |
| Anti-Ezrin | Sigma-Aldrich | clone3C12, SAB4200806 | |
| Anti-Galphaq | Santacruz | sc-393 | |
| Anti-MAP2 | Chemicon | clone AP20, MAB3418 | |
| Anti-Moesin | Sigma-Aldrich | clone 38/87, M7060 | |
| Anti-PLCbeta1 | Santacuz | sc-5291 | |
| Anti-PSD95 | MA2 | ABR | |
| Anti-Spectrin beta | Chemicon | MAB1622 | |
| B27 | Gibco | 0080085SA | |
| BCA protein assay kit | Thermo | 23227 | |
| Bromophenol blue | Merck | 1.08122.0005 | |
| calcium chrolide, hydrous | Wako | 038-19735 | |
| Cell scraper | Falcon | 353085 | |
| Cell strainer | Falcon | 352350 | |
| Choline chloride | Sigma-Aldrich | C7527 | |
| Complete EDTA free protease inhibitor cocktail | Roche | 11873580001 | |
| Cytosine beta-D-arabinofuranoside | Sigma-Aldrich | C-6645 | |
| DNase-I | Sigma-Aldrich | DN-25 | |
| D-Pantothenic acid hemicalcium salt | Sigma-Aldrich | P5155 | |
| DynaMag-2 Magnet | Thermo | 12321D | |
| ECL Prime Western Blotting Detection Reagent | GE | RPN2232 | |
| e-PAGEL 5-20% SDS-PAGE gradient gel | ATTO | E-T520L | |
| Folic acid | Sigma-Aldrich | F8758 | |
| HBSS | Gibco | 14175095 | |
| HRP-conjugated anti-rabbit IgG | Jackson ImmunoResearch | 111-035-144 | |
| i-Inositol | Sigma-Aldrich | I7508 | |
| LAS-1000 mini | Fuji Film | LAS-1000 mini | For detection of luminescence from WB membrane |
| Magnetic polystyrene microbeads | Sperotech | PM-20-10 | |
| MEM amino acid solution | Gibco | 11130-051 | 30 mM L-Arginine hydrochloride, 5 mM L-Cystine, 10 mM L-Histidine hydrochloride-H2O, 20 mM L-Isoleucine, 20 mM L-Leucine, 19.8 mM L-Lysine hydrochloride, 5.1 mM L-Methionine, 10 mM L-Phenylalanine, 20 mM L-Threonine, 2.5 mM L-Tryptophan, 10 mM L-Tyrosine, and 20 mM L-Valine |
| Mini-slab size electrophoresis system | ATTO | AE-6530 | |
| Niacinamide | Sigma-Aldrich | N0636 | |
| Penicilin / Streptomycin | Gibco | 15070063 | |
| PhosSTOP phosphatase inhibitor cocktail | Roche | 4906845001 | |
| Poly-L-lysine hydrobromide | Nacali | 28360-14 | |
| Pyridoxal HCl | Sigma-Aldrich | P6155 | |
| Riboflavin | Sigma-Aldrich | R9504 | |
| Silver Stain 2 Kit wako | Wako | 291-5031 | |
| Thiamine HCl | Sigma-Aldrich | T1270 | |
| Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer Cell | Bio-rad | 1703940JA | |
| Ultra pure water | MilliQ | For production of ultra pure water |
Riferimenti
- Fiala, J. C., Feinberg, M., Popov, V., Harris, K. M. Synaptogenesis via dendritic filopodia in developing hippocampal area CA1. Journal of Neuroscience. 18 (21), 8900-8911 (1998).
- Portera-Cailliau, C., Pan, D. T., Yuste, R. Activity-regulated dynamic behavior of early dendritic protrusions: evidence for different types of dendritic filopodia. Journal of Neuroscience. 23 (18), 7129-7142 (2003).
- Ziv, N. E., Smith, S. J. Evidence for a role of dendritic filopodia in synaptogenesis and spine formation. Neuron. 17 (1), 91-102 (1996).
- Lohmann, C., Bonhoeffer, T. A role for local calcium signaling in rapid synaptic partner selection by dendritic filopodia. Neuron. 59 (2), 253-260 (2008).
- Yoshihara, Y., De Roo, M., Muller, D. Dendritic spine formation and stabilization. Current Opinion in Neurobiology. 19 (2), 146-153 (2009).
- Bayes, A., et al. Comparative study of human and mouse postsynaptic proteomes finds high compositional conservation and abundance differences for key synaptic proteins. PLoS One. 7 (10), e46683 (2012).
- Bayes, A., et al. Characterization of the proteome, diseases and evolution of the human postsynaptic density. Nature Neuroscience. 14 (1), 19-21 (2011).
- Furutani, Y., et al. Interaction between telencephalin and ERM family proteins mediates dendritic filopodia formation. Journal of Neuroscience. 27 (33), 8866-8876 (2007).
- Mao, Y. T., et al. Filopodia Conduct Target Selection in Cortical Neurons Using Differences in Signal Kinetics of a Single Kinase. Neuron. 98 (4), 767-782 (2018).
- Matsuno, H., et al. Telencephalin slows spine maturation. Journal of Neuroscience. 26 (6), 1776-1786 (2006).
- Raemaekers, T., et al. ARF6-mediated endosomal transport of Telencephalin affects dendritic filopodia-to-spine maturation. The EMBO Journal. 31 (15), 3252-3269 (2012).
- Mori, K., Fujita, S. C., Watanabe, Y., Obata, K., Hayaishi, O. Telencephalon-specific antigen identified by monoclonal antibody. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 84 (11), 3921-3925 (1987).
- Yoshihara, Y., Mori, K. Telencephalin: a neuronal area code molecule?. Neuroscience Research. 21 (2), 119-124 (1994).
- Annaert, W. G., et al. Interaction with telencephalin and the amyloid precursor protein predicts a ring structure for presenilins. Neuron. 32 (4), 579-589 (2001).
- Furutani, Y., et al. Vitronectin induces phosphorylation of ezrin/radixin/moesin actin-binding proteins through binding to its novel neuronal receptor telencephalin. Journal of Biological Chemistry. 287 (46), 39041-39049 (2012).
- Nyman-Huttunen, H., Tian, L., Ning, L., Gahmberg, C. G. alpha-Actinin-dependent cytoskeletal anchorage is important for ICAM-5-mediated neuritic outgrowth. Journal of Cell Biology. 119 (Pt 15), 3057-3066 (2006).
- Esselens, C., et al. Presenilin 1 mediates the turnover of telencephalin in hippocampal neurons via an autophagic degradative pathway. Journal of Cell Biology. 166 (7), 1041-1054 (2004).
- Furutani, Y., Yoshihara, Y. Proteomic Analysis of Dendritic Filopodia-Rich Fraction Isolated by Telencephalin and Vitronectin Interaction. Frontiers in Synaptic Neuroscience. 10, 27 (2018).
- Lu, Z., Piechowicz, M., Qiu, S. A Simplified Method for Ultra-Low Density, Long-Term Primary Hippocampal Neuron Culture. Journal of Visualized Experiments. (109), (2016).
- Okabe, S., Miwa, A., Okado, H. Alternative splicing of the C-terminal domain regulates cell surface expression of the NMDA receptor NR1 subunit. The Journal of Neuroscience. 19 (18), 7781-7792 (1999).
- Okabe, S., Vicario-Abejon, C., Segal, M., McKay, R. D. Survival and synaptogenesis of hippocampal neurons without NMDA receptor function in culture. European Journal of Neuroscience. 10 (6), 2192-2198 (1998).
