Zuivering van de dendritische Filopodia-rijke Fractie
Summary
In dit protocol introduceren we een methode voor het zuiveren van de dendritische filopodia-rijke Fractie van de phagocytische beker-achtige uitsteeksel structuur op gekweekte hippocampal neuronen door gebruik te maken van de specifieke en sterke affiniteit tussen een dendritische filopodial adhesie molecuul, TLCN, en een extracellulaire matrix molecuul, vitronectine.
Abstract
Dendritische filopodia zijn dunne en lange uitsteeksels op basis van de actine filament, en ze verlengen en intrekken alsof ze zoeken naar een doel-axon. Wanneer de dendritische filopodia contact leggen met een doel-axon, beginnen ze te rijpen in stekels, wat leidt tot de vorming van een synaps. Telencephalin (TLCN) is overvloedig gelokaliseerd in dendritische filopodia en wordt geleidelijk uitgesloten van stekels. Overexpressie van TLCN in gekweekte hippocampal neuronen induceert dendritische filopodia vorming. We toonden aan dat telencephalin sterk bindt aan een extracellulair matrix molecuul, vitronectine. Vitronectin-gecoate microbeads geïnduceerde fagocytische beker vorming op neuronale dendrieten. In de fagocytische beker worden TLCN, TLCN-bindende eiwitten zoals gefosforyleerd Ezrin/Radixin/Moesin (phospho-ERM) en F-actin verzameld, wat suggereert dat componenten van de phagocytische beker vergelijkbaar zijn met die van dendritische filopodia. Zo ontwikkelden we een methode voor het zuiveren van de fagocytische beker in plaats van dendritische filopodia. Magnetische polystyreen kralen werden bekleed met vitronectine, die overvloedig aanwezig is in het cultuurmedium van hippocampal neuronen en die fagocytische beker vorming op neuronale dendrieten induceert. Na 24 uur incubatie werden de fagocytische bekers mild gesolubiliseerd met wasmiddel en verzameld met behulp van een Magneet separator. Na het wassen van de kralen werden de bindende eiwitten geeluteerd en geanalyseerd door zilver kleuring en Western blotting. In de bindende fractie waren TLCN en actine overvloedig aanwezig. Bovendien werden veel eiwitten die uit de Fractie werden geïdentificeerd, gelokaliseerd in de dendritische filopodia; zo noemden we de bindende fractie als de dendritische filopodia-rijke Fractie. Dit artikel beschrijft de details met betrekking tot de zuiveringsmethode voor de dendritische filopodia-Rich Fractie.
Introduction
Dendritische filopodia wordt beschouwd als voorlopers van stekels. Actin filamenten in de dendritische filopodia reguleren hun verlenging en terugtrekking1,2,3. Na contact met een axon beginnen geselecteerde dendritische filopodia hun rijping in stekels en wordt een synaps gevormd op4,5. Componenten van stekels zijn vastgesteld aan de hand van een uitgebreide analyse van postsynaptische dichtheids fracties6,7, terwijl de componenten van dendritische filopodia grotendeels onbekend blijven. Het is aangetoond dat telencephalin (tlcn), ERM, syngap, ras, PI3 kinase, Akt, mtor, Polo-achtige kinase 2, camkii, syndecan-2, paralemin-1, ARF6, en ephb reguleren dendritische filopodia vorming5,8,9 ,10,11, terwijl een methode niet is ontwikkeld voor de uitgebreide analyse van moleculen die in de dendritische filopodia aanwezig zijn.
Tlcn (ICAM-5) wordt specifiek uitgedrukt door stekelige neuronen in het meest rostrale migratoire hersen segment, de telencephalon12. TLCN heeft 9 Ig-achtige domeinen in de extracellulaire regio, een transmembraan regio, en een cytoplasmische staart13. Tlcn bindt aan vitronectine (VN) en LFA-1 integrine in zijn extracellulaire regio, aan presenilin in zijn transmembraan regio, en aan fosho-ERM en α-actinine in de cytoplasmische regio5,8,14,15 ,16. Tlcn bindt aan de actine cytoskelet via fosho-ERM op de uiteinden van dendritische filopodia en α-actinine in stekels en dendritische assen8,16.
We toonden aan dat overexpressie van tlcn verbeterde dendritische filopodia-formatie en de reversie van stekels veroorzaakte tot filopodia10. De constitutieve actieve vorm van Ezrin gebonden aan de TLCN cytoplasmatische regio en verbeterde dendritische filopodia formatie8. Zo reguleert TLCN de vorming van dendritische filopodia door middel van actin-bindende eiwitten. Esselens et al. heeft aangetoond dat microbeads de accumulatie van TLCN op gekweekte neuronen17induceerde. We toonden aan dat de fagocytische beker structuren werden gevormd op neuronale dendrites rond VN-gecoate microbeads in een TLCN-afhankelijke manier15. Bestanddelen van dendritische filopodia lijken op die van de phagocytische beker. Het is moeilijk om dendritische filopodia te verzamelen, maar het is relatief gemakkelijker om de phagocytische beker te verzamelen met behulp van magnetische microbeads. Zo ontwikkelden we een methode om de fagocytische beker te zuiveren in plaats van dendritische filopodia18. Hier beschrijven we de zuiveringsmethode voor de dendritische filopodia-rijke Fractie.
Protocol
Representative Results
Discussion
We ontwikkelden een zuiveringsmethode voor de dendritische filopodia-rijke fractie met behulp van affiniteit tussen de celadhesie molecule TLCN en het extracellulaire matrix eiwit vitronectine. Vergeleken met de PSD-Fractie, kan het mogelijk zijn om de synaptische eiwitten te identificeren die op de onrijpe Synapse van de dendritische filopodia-rijke fractie optreden. De bestanddelen van de dendritische filopodia-Rich fractie verschillen dus van die van de PSD-fractie met 74%. Anders dan PSD-Fractie, gebruikten we gekwee…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We bedanken Shigeo Okabe en Hitomi Matsuno voor de lage-densiteit cultuur van hippocampal neuronen, Masayoshi Mishina voor TLCN-deficiënte muizen, Sachiko Mitsui en Momoko Shiozaki voor technische assistentie, en leden van het Yoshihara laboratorium voor nuttige discussies . Dit werk werd gesteund door JSPS KAKENHI Grant NOS. JP20700307, JP22700354 en JP24500392 en MEXT KAKENHI Grant NOS. JP23123525 naar YF en JP20022046, JP18H04683, en JP18H05146 naar YY.
Materials
| 1 M HEPES | Gibco | 15630-080 | |
| 1.7 ml Low Binding MCT | Sorenson BioScience | 39640T | |
| 200 mM L-Glutamine | Gibco | 2530149 | |
| 35-mm plastic cell culture dishes | Corning | 430165 | |
| Anti-actin | Sigma-Aldrich | A-5060 | |
| Anti-alpha-Actinin | Sigma-Aldrich | A-5044 | |
| Anti-alpha-tubulin | Sigma-Aldrich | T-9026 | |
| Anti-Ezrin | Sigma-Aldrich | clone3C12, SAB4200806 | |
| Anti-Galphaq | Santacruz | sc-393 | |
| Anti-MAP2 | Chemicon | clone AP20, MAB3418 | |
| Anti-Moesin | Sigma-Aldrich | clone 38/87, M7060 | |
| Anti-PLCbeta1 | Santacuz | sc-5291 | |
| Anti-PSD95 | MA2 | ABR | |
| Anti-Spectrin beta | Chemicon | MAB1622 | |
| B27 | Gibco | 0080085SA | |
| BCA protein assay kit | Thermo | 23227 | |
| Bromophenol blue | Merck | 1.08122.0005 | |
| calcium chrolide, hydrous | Wako | 038-19735 | |
| Cell scraper | Falcon | 353085 | |
| Cell strainer | Falcon | 352350 | |
| Choline chloride | Sigma-Aldrich | C7527 | |
| Complete EDTA free protease inhibitor cocktail | Roche | 11873580001 | |
| Cytosine beta-D-arabinofuranoside | Sigma-Aldrich | C-6645 | |
| DNase-I | Sigma-Aldrich | DN-25 | |
| D-Pantothenic acid hemicalcium salt | Sigma-Aldrich | P5155 | |
| DynaMag-2 Magnet | Thermo | 12321D | |
| ECL Prime Western Blotting Detection Reagent | GE | RPN2232 | |
| e-PAGEL 5-20% SDS-PAGE gradient gel | ATTO | E-T520L | |
| Folic acid | Sigma-Aldrich | F8758 | |
| HBSS | Gibco | 14175095 | |
| HRP-conjugated anti-rabbit IgG | Jackson ImmunoResearch | 111-035-144 | |
| i-Inositol | Sigma-Aldrich | I7508 | |
| LAS-1000 mini | Fuji Film | LAS-1000 mini | For detection of luminescence from WB membrane |
| Magnetic polystyrene microbeads | Sperotech | PM-20-10 | |
| MEM amino acid solution | Gibco | 11130-051 | 30 mM L-Arginine hydrochloride, 5 mM L-Cystine, 10 mM L-Histidine hydrochloride-H2O, 20 mM L-Isoleucine, 20 mM L-Leucine, 19.8 mM L-Lysine hydrochloride, 5.1 mM L-Methionine, 10 mM L-Phenylalanine, 20 mM L-Threonine, 2.5 mM L-Tryptophan, 10 mM L-Tyrosine, and 20 mM L-Valine |
| Mini-slab size electrophoresis system | ATTO | AE-6530 | |
| Niacinamide | Sigma-Aldrich | N0636 | |
| Penicilin / Streptomycin | Gibco | 15070063 | |
| PhosSTOP phosphatase inhibitor cocktail | Roche | 4906845001 | |
| Poly-L-lysine hydrobromide | Nacali | 28360-14 | |
| Pyridoxal HCl | Sigma-Aldrich | P6155 | |
| Riboflavin | Sigma-Aldrich | R9504 | |
| Silver Stain 2 Kit wako | Wako | 291-5031 | |
| Thiamine HCl | Sigma-Aldrich | T1270 | |
| Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer Cell | Bio-rad | 1703940JA | |
| Ultra pure water | MilliQ | For production of ultra pure water |
Riferimenti
- Fiala, J. C., Feinberg, M., Popov, V., Harris, K. M. Synaptogenesis via dendritic filopodia in developing hippocampal area CA1. Journal of Neuroscience. 18 (21), 8900-8911 (1998).
- Portera-Cailliau, C., Pan, D. T., Yuste, R. Activity-regulated dynamic behavior of early dendritic protrusions: evidence for different types of dendritic filopodia. Journal of Neuroscience. 23 (18), 7129-7142 (2003).
- Ziv, N. E., Smith, S. J. Evidence for a role of dendritic filopodia in synaptogenesis and spine formation. Neuron. 17 (1), 91-102 (1996).
- Lohmann, C., Bonhoeffer, T. A role for local calcium signaling in rapid synaptic partner selection by dendritic filopodia. Neuron. 59 (2), 253-260 (2008).
- Yoshihara, Y., De Roo, M., Muller, D. Dendritic spine formation and stabilization. Current Opinion in Neurobiology. 19 (2), 146-153 (2009).
- Bayes, A., et al. Comparative study of human and mouse postsynaptic proteomes finds high compositional conservation and abundance differences for key synaptic proteins. PLoS One. 7 (10), e46683 (2012).
- Bayes, A., et al. Characterization of the proteome, diseases and evolution of the human postsynaptic density. Nature Neuroscience. 14 (1), 19-21 (2011).
- Furutani, Y., et al. Interaction between telencephalin and ERM family proteins mediates dendritic filopodia formation. Journal of Neuroscience. 27 (33), 8866-8876 (2007).
- Mao, Y. T., et al. Filopodia Conduct Target Selection in Cortical Neurons Using Differences in Signal Kinetics of a Single Kinase. Neuron. 98 (4), 767-782 (2018).
- Matsuno, H., et al. Telencephalin slows spine maturation. Journal of Neuroscience. 26 (6), 1776-1786 (2006).
- Raemaekers, T., et al. ARF6-mediated endosomal transport of Telencephalin affects dendritic filopodia-to-spine maturation. The EMBO Journal. 31 (15), 3252-3269 (2012).
- Mori, K., Fujita, S. C., Watanabe, Y., Obata, K., Hayaishi, O. Telencephalon-specific antigen identified by monoclonal antibody. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 84 (11), 3921-3925 (1987).
- Yoshihara, Y., Mori, K. Telencephalin: a neuronal area code molecule?. Neuroscience Research. 21 (2), 119-124 (1994).
- Annaert, W. G., et al. Interaction with telencephalin and the amyloid precursor protein predicts a ring structure for presenilins. Neuron. 32 (4), 579-589 (2001).
- Furutani, Y., et al. Vitronectin induces phosphorylation of ezrin/radixin/moesin actin-binding proteins through binding to its novel neuronal receptor telencephalin. Journal of Biological Chemistry. 287 (46), 39041-39049 (2012).
- Nyman-Huttunen, H., Tian, L., Ning, L., Gahmberg, C. G. alpha-Actinin-dependent cytoskeletal anchorage is important for ICAM-5-mediated neuritic outgrowth. Journal of Cell Biology. 119 (Pt 15), 3057-3066 (2006).
- Esselens, C., et al. Presenilin 1 mediates the turnover of telencephalin in hippocampal neurons via an autophagic degradative pathway. Journal of Cell Biology. 166 (7), 1041-1054 (2004).
- Furutani, Y., Yoshihara, Y. Proteomic Analysis of Dendritic Filopodia-Rich Fraction Isolated by Telencephalin and Vitronectin Interaction. Frontiers in Synaptic Neuroscience. 10, 27 (2018).
- Lu, Z., Piechowicz, M., Qiu, S. A Simplified Method for Ultra-Low Density, Long-Term Primary Hippocampal Neuron Culture. Journal of Visualized Experiments. (109), (2016).
- Okabe, S., Miwa, A., Okado, H. Alternative splicing of the C-terminal domain regulates cell surface expression of the NMDA receptor NR1 subunit. The Journal of Neuroscience. 19 (18), 7781-7792 (1999).
- Okabe, S., Vicario-Abejon, C., Segal, M., McKay, R. D. Survival and synaptogenesis of hippocampal neurons without NMDA receptor function in culture. European Journal of Neuroscience. 10 (6), 2192-2198 (1998).
