טיהור של הדנדריטים הדנדריפיאה-חלק עשיר
Summary
בפרוטוקול זה, אנו מציגים שיטה לטיהור החלק הדנדריטי-עשיר של השבר הדנדריטים של הגביע phagocytic כמו מבנה בליטה על הנוירונים היפוקמאל תרבותי על ידי ניצול הזיקה הספציפית והחזקה בין מחוגה הדנדריטי מולקולת הדבקה, TLCN ומולקולת מטריקס בעלי מטריצה, vitronectin.
Abstract
פילפאות דנדריטי הן בליטות דקות וארוכות המבוססות על הפילטין, והן מרחיבות ומסגת כאילו מחפשים מטרה אקסון. כאשר filפאות הדנדריטים ליצור קשר עם axon היעד, הם מתחילים התבגרות לתוך הקוצים, המוביל היווצרות סינפסה. Telencephalin (TLCN) הוא מקומי בשפע בפילפיאה דנדריטי והוא נשלל בהדרגה מהקוצים. הבעות יתר של TLCN בנוירונים מתורבתים היפוקמאל מעוררת היווצרות הדנדריטים. הצגנו שtelencephalin מאגד בחוזקה למולקולה של מטריקס, ויטרופקטין. ויטרופקטין מצופה בחרוזי מיקרו-חרוזים. שנגרמה כתוצאה מהדנדריטים העצביים בגביע phagocytic, TLCN, טלCN-מחייב חלבונים כגון זרחנת אזרין/Radixin/מוסין (פוספהו-אה), ו-F-actin נצבר, אשר מציע כי מרכיבים של הגביע phagocytic דומים לאלה של פילפיאה הדנדריטי. לכן, פיתחנו שיטה לטיהור הגביע phagocytic במקום filפאות הדנדריטים. חרוזי קלקר מגנטיים היו מצופים vitronectin, אשר בשפע בתווך התרבות של נוירונים היפוקמאל ואשר משרה היווצרות גביע phagocytic על הדנדריטים העצביים. לאחר 24 שעות של דגירה, כוסות phagocytic היו מסיסות במקצת עם חומרי ניקוי ונאסף באמצעות מפריד מגנט. לאחר שטיפת החרוזים, החלבונים המחייבים היו מנותחים ונותחו על ידי כתמים מכסף וכתמים מערביים. בשבר הכריכה, tlcn ו-אקטין היו נוכחים בשפע. בנוסף, חלבונים רבים שזוהו מן השבר היו מותאמים לפילפיאה הדנדריטי; לכן, קראנו את השבר המחייב כמו השבר הדנדריפיאה-עשיר. מאמר זה מתאר פרטים בנוגע לשיטת הטיהור של השבר הדנדריטי-עשיר.
Introduction
פילפיאה דנדריטי נחשבים להיות סמנים מוקדמים של שפני השדרה. שקעים לוויסות השלוחה והנסיגה שלהם1,2,3. לאחר יצירת קשר עם axon, הדנדריטים הדנדריטי הנבחר להתחיל ההבשלה שלהם לתוך השדרה, ו סינפסה נוצרת4,5. מרכיבים של שפני השדרה נקבעו מניתוח מקיף של שברים בצפיפות הפוסט-סינפטיות6,7, בעוד שרכיבים של פילופיאה דנדריטי נשארים לא ידועים. הוכח כי telencephalin (tlcn), אה, סינקופה, ראס, PI3 קינאז, akt, mtor, פולו-כמו קינאז 2, camkii, syndecan-2, paralemin-1, ARF6, ולהסדיר את המבנה הדנדריטי הדנדריטים5,8,9 ,10,11, בעוד שיטה לא פותחה עבור ניתוח מקיף של מולקולות נוכח בפילפיאה הדנדריטי.
TLCN (ICAM-5) מתבטאת במיוחד על ידי נוירונים קוצני בחלק המוח הrostral ביותר, הטלנצאלון12. TLCN 9 תחומים כמו Ig באזור החילוץ שלה, אזור טרנסקרום, ו cytoplasmic זנב13. Tlcn נקשר ל vitronectin (VN) ו-lfa-1 אינטגרציה באזור המוטרתאי שלה, לפרזלין באזור הטרנסג שלה, ולפואהו-אה ולα-אקטין באזור cytoplasmic5,8,14,15 ,16. Tlcn נקשר לשלד ציטוטין באמצעות פוספהו-אה בקצות הפילפיאה הדנדרידיה ובα-אקמין ב שבקוצים ופירים דנדריטים8,16.
הראנו כי ביטוי יתר של TLCN היווצרות הדנדריטים הדנדריטי משופרת והמושרה גרסה מחודשת של השדרה לפילפיאה10. הצורה האקטיבית והפעילה של אזרין כרוך באזור cytoplasmic של TLCN ובמערך הדנדריטים הדנדריטי המשופר8. לפיכך, TLCN מווסת את היווצרות הדנדריטים הדנדריטי דרך actin-מחייב חלבונים. Esselens ואח ‘ הפגינו כי מיקרוחרוזים המושרה הצטברות TLCN על נוירונים מתורבתים17. הצגנו כי מבנים של גביע phagocytic הוקמה על הדנדריטים העצביים סביב מיקרוחרוזי VN מצופה באמצעות TLCN באופן תלוי15. מרכיבים של פילפיאה דנדריטי דומים לאלה של הגביע phagocytic. קשה לאסוף filפאות הדנדריטים, אבל זה קל יחסית לאסוף את הגביע phagocytic באמצעות מיקרוחרוזי מגנטי. לכן, פיתחנו שיטה כדי לטהר את הגביע phagocytic במקום filפיאה הדנדריטים18. כאן, אנו מתארים את שיטת הטיהור עבור השבר הדנדריפיאה עשיר.
Protocol
Representative Results
Discussion
פיתחנו שיטת טיהור עבור השבר הדנדריטים הדנדריפיאה-עשיר באמצעות זיקה בין מולקולת תא הדבקה TLCN לבין מטריקס חלבון מטריצה vitronectin. בהשוואה לשבר PSD, זה יכול להיות אפשרי כדי לזהות את החלבונים סינפטיות פועל על הסינפסה בלתי בוגר מן השבר הדנדריטי-עשיר. לפיכך, המרכיבים של השבר הדנדריטי-עשיר, שונים מאלה …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים Shigeo Okabe ו היטומי Matsuno עבור התרבות בצפיפות נמוכה של נוירונים היפוקמאל, מסאיושי מישנה עבור העכברים TLCN-לקויה, Sachiko מיצ ו מומוקו Shioזאקי לסיוע טכני, וחברי המעבדה יושיהארה לדיונים מועילים . עבודה זו נתמכת על ידי JSPS KAKENHI גרנט Nos. JP20700307, JP22700354, ו JP24500392 ו-MEXT KAKENHI גרנט Nos. JP23123525 ל-YF ו-JP20022046, JP18H04683 וJP18H05146 ל-YY.
Materials
| 1 M HEPES | Gibco | 15630-080 | |
| 1.7 ml Low Binding MCT | Sorenson BioScience | 39640T | |
| 200 mM L-Glutamine | Gibco | 2530149 | |
| 35-mm plastic cell culture dishes | Corning | 430165 | |
| Anti-actin | Sigma-Aldrich | A-5060 | |
| Anti-alpha-Actinin | Sigma-Aldrich | A-5044 | |
| Anti-alpha-tubulin | Sigma-Aldrich | T-9026 | |
| Anti-Ezrin | Sigma-Aldrich | clone3C12, SAB4200806 | |
| Anti-Galphaq | Santacruz | sc-393 | |
| Anti-MAP2 | Chemicon | clone AP20, MAB3418 | |
| Anti-Moesin | Sigma-Aldrich | clone 38/87, M7060 | |
| Anti-PLCbeta1 | Santacuz | sc-5291 | |
| Anti-PSD95 | MA2 | ABR | |
| Anti-Spectrin beta | Chemicon | MAB1622 | |
| B27 | Gibco | 0080085SA | |
| BCA protein assay kit | Thermo | 23227 | |
| Bromophenol blue | Merck | 1.08122.0005 | |
| calcium chrolide, hydrous | Wako | 038-19735 | |
| Cell scraper | Falcon | 353085 | |
| Cell strainer | Falcon | 352350 | |
| Choline chloride | Sigma-Aldrich | C7527 | |
| Complete EDTA free protease inhibitor cocktail | Roche | 11873580001 | |
| Cytosine beta-D-arabinofuranoside | Sigma-Aldrich | C-6645 | |
| DNase-I | Sigma-Aldrich | DN-25 | |
| D-Pantothenic acid hemicalcium salt | Sigma-Aldrich | P5155 | |
| DynaMag-2 Magnet | Thermo | 12321D | |
| ECL Prime Western Blotting Detection Reagent | GE | RPN2232 | |
| e-PAGEL 5-20% SDS-PAGE gradient gel | ATTO | E-T520L | |
| Folic acid | Sigma-Aldrich | F8758 | |
| HBSS | Gibco | 14175095 | |
| HRP-conjugated anti-rabbit IgG | Jackson ImmunoResearch | 111-035-144 | |
| i-Inositol | Sigma-Aldrich | I7508 | |
| LAS-1000 mini | Fuji Film | LAS-1000 mini | For detection of luminescence from WB membrane |
| Magnetic polystyrene microbeads | Sperotech | PM-20-10 | |
| MEM amino acid solution | Gibco | 11130-051 | 30 mM L-Arginine hydrochloride, 5 mM L-Cystine, 10 mM L-Histidine hydrochloride-H2O, 20 mM L-Isoleucine, 20 mM L-Leucine, 19.8 mM L-Lysine hydrochloride, 5.1 mM L-Methionine, 10 mM L-Phenylalanine, 20 mM L-Threonine, 2.5 mM L-Tryptophan, 10 mM L-Tyrosine, and 20 mM L-Valine |
| Mini-slab size electrophoresis system | ATTO | AE-6530 | |
| Niacinamide | Sigma-Aldrich | N0636 | |
| Penicilin / Streptomycin | Gibco | 15070063 | |
| PhosSTOP phosphatase inhibitor cocktail | Roche | 4906845001 | |
| Poly-L-lysine hydrobromide | Nacali | 28360-14 | |
| Pyridoxal HCl | Sigma-Aldrich | P6155 | |
| Riboflavin | Sigma-Aldrich | R9504 | |
| Silver Stain 2 Kit wako | Wako | 291-5031 | |
| Thiamine HCl | Sigma-Aldrich | T1270 | |
| Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer Cell | Bio-rad | 1703940JA | |
| Ultra pure water | MilliQ | For production of ultra pure water |
Riferimenti
- Fiala, J. C., Feinberg, M., Popov, V., Harris, K. M. Synaptogenesis via dendritic filopodia in developing hippocampal area CA1. Journal of Neuroscience. 18 (21), 8900-8911 (1998).
- Portera-Cailliau, C., Pan, D. T., Yuste, R. Activity-regulated dynamic behavior of early dendritic protrusions: evidence for different types of dendritic filopodia. Journal of Neuroscience. 23 (18), 7129-7142 (2003).
- Ziv, N. E., Smith, S. J. Evidence for a role of dendritic filopodia in synaptogenesis and spine formation. Neuron. 17 (1), 91-102 (1996).
- Lohmann, C., Bonhoeffer, T. A role for local calcium signaling in rapid synaptic partner selection by dendritic filopodia. Neuron. 59 (2), 253-260 (2008).
- Yoshihara, Y., De Roo, M., Muller, D. Dendritic spine formation and stabilization. Current Opinion in Neurobiology. 19 (2), 146-153 (2009).
- Bayes, A., et al. Comparative study of human and mouse postsynaptic proteomes finds high compositional conservation and abundance differences for key synaptic proteins. PLoS One. 7 (10), e46683 (2012).
- Bayes, A., et al. Characterization of the proteome, diseases and evolution of the human postsynaptic density. Nature Neuroscience. 14 (1), 19-21 (2011).
- Furutani, Y., et al. Interaction between telencephalin and ERM family proteins mediates dendritic filopodia formation. Journal of Neuroscience. 27 (33), 8866-8876 (2007).
- Mao, Y. T., et al. Filopodia Conduct Target Selection in Cortical Neurons Using Differences in Signal Kinetics of a Single Kinase. Neuron. 98 (4), 767-782 (2018).
- Matsuno, H., et al. Telencephalin slows spine maturation. Journal of Neuroscience. 26 (6), 1776-1786 (2006).
- Raemaekers, T., et al. ARF6-mediated endosomal transport of Telencephalin affects dendritic filopodia-to-spine maturation. The EMBO Journal. 31 (15), 3252-3269 (2012).
- Mori, K., Fujita, S. C., Watanabe, Y., Obata, K., Hayaishi, O. Telencephalon-specific antigen identified by monoclonal antibody. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 84 (11), 3921-3925 (1987).
- Yoshihara, Y., Mori, K. Telencephalin: a neuronal area code molecule?. Neuroscience Research. 21 (2), 119-124 (1994).
- Annaert, W. G., et al. Interaction with telencephalin and the amyloid precursor protein predicts a ring structure for presenilins. Neuron. 32 (4), 579-589 (2001).
- Furutani, Y., et al. Vitronectin induces phosphorylation of ezrin/radixin/moesin actin-binding proteins through binding to its novel neuronal receptor telencephalin. Journal of Biological Chemistry. 287 (46), 39041-39049 (2012).
- Nyman-Huttunen, H., Tian, L., Ning, L., Gahmberg, C. G. alpha-Actinin-dependent cytoskeletal anchorage is important for ICAM-5-mediated neuritic outgrowth. Journal of Cell Biology. 119 (Pt 15), 3057-3066 (2006).
- Esselens, C., et al. Presenilin 1 mediates the turnover of telencephalin in hippocampal neurons via an autophagic degradative pathway. Journal of Cell Biology. 166 (7), 1041-1054 (2004).
- Furutani, Y., Yoshihara, Y. Proteomic Analysis of Dendritic Filopodia-Rich Fraction Isolated by Telencephalin and Vitronectin Interaction. Frontiers in Synaptic Neuroscience. 10, 27 (2018).
- Lu, Z., Piechowicz, M., Qiu, S. A Simplified Method for Ultra-Low Density, Long-Term Primary Hippocampal Neuron Culture. Journal of Visualized Experiments. (109), (2016).
- Okabe, S., Miwa, A., Okado, H. Alternative splicing of the C-terminal domain regulates cell surface expression of the NMDA receptor NR1 subunit. The Journal of Neuroscience. 19 (18), 7781-7792 (1999).
- Okabe, S., Vicario-Abejon, C., Segal, M., McKay, R. D. Survival and synaptogenesis of hippocampal neurons without NMDA receptor function in culture. European Journal of Neuroscience. 10 (6), 2192-2198 (1998).
