Purificazione della Frazione ricca di Filopodia Dendritica
Summary
In questo protocollo, introduciamo un metodo per purificare la frazione dendritica ricca di filopodia dalla struttura di protrusione simile a una coppa fagocitica sui neuroni ippocampali coltivati sfruttando l’affinità specifica e forte tra un filopopodiale dendritico molecola di adesione, TLCN, e una molecola di matrice extracellulare, vitronectina.
Abstract
I filodidi dendrici sono sporche sottili e lunghe basate sul filamento di actin, e si estendono e si ritraggono come se cercassero un assone bersaglio. Quando la filopodia dendritica stabilisce il contatto con un assone bersaglio, iniziano a maturare in spine, portando alla formazione di una sinapsi. La telencefine (TLCN) è abbondantemente localizzata nella filopodia dendritica ed è gradualmente esclusa dalle spine. La sovraespressione del TLCN nei neuroni ippocampali coltivati induce la formazione di filopodia dendritica. Abbiamo dimostrato che la telencefine si lega fortemente a una molecola di matrice extracellulare, la vitronectina. Le microsfere rivestite di cellavanguardia in vitronectine hanno indotto la formazione di coppe fagocitiche sui dendriti neuronali. Nella tazza fagocitica, si accumulano proteine che legano il TLCN, come Ezrin/Radixin/Moesin (phospho-ERM), e F-actin, il che suggerisce che i componenti della coppa fagocitica sono simili a quelli della filodia dendritica. Così, abbiamo sviluppato un metodo per purificare la coppa fagocitica invece di filopodi a dendritica. Le perle di polistirene magnetico sono state rivestite con vitronectina, che è abbondantemente presente nel mezzo di coltura dei neuroni ippocampali e che induce la formazione di coppe fagocitiche sui dendriti neuronali. Dopo 24 h di incubazione, le tazze fagocitiche erano leggermente solubili con detergente e raccolte utilizzando un separatore magnete. Dopo aver lavato le perline, le proteine leganti sono state eluite e analizzate dalla colorazione d’argento e dalla gonfiore occidentale. Nella frazione vincolante, TLCN e actin erano abbondantemente presenti. Inoltre, molte proteine identificate dalla frazione sono state localizzate alla filopodica dendritica; così, abbiamo chiamato la frazione di legame come la frazione dendritica ricca di filopodia. Questo articolo descrive i dettagli relativi al metodo di purificazione per la frazione dendritica ricca di filopodia.
Introduction
Si pensa che la filopodi dendritica sia precursore delle spine. I filamenti di Actin nella filopodi adendriticane regolano l’estensione e la retrazione 1,2,3. Dopo aver contattato un assone, la filopodia dendritica selezionata inizia la loro maturazione in spine, e si forma una sinapsi4,5. I componenti delle spine sono stati determinati dall’analisi completa delle frazioni di densità postsinaptica6,7, mentre i componenti della filopodia dendritica rimangono in gran parte sconosciuti. È stato dimostrato che telencephalin (TLCN), ERM, SynGAP, Ras, PI3 kinase, Akt, mTOR, polo-like kinase 2, CaMKII, syndecan-2, paralemin-1, ARF6, e EphB regolano la formazione di filopodi dendritici5,8,9 ,10,11, mentre un metodo non è stato sviluppato per l’analisi completa delle molecole presenti nella filopodia dendritica.
TLCN (ICAM-5) è specificamente espresso dai neuroni spinosi nel segmento cerebrale più rostrale, il telencephalon12. TLCN ha 9 domini simili a Ig nella sua regione extracellulare, una regione transmembrana e una coda citoplasmica13. TLCN si lega alla vitronectina (VN) e all’integrina LFA-1 nella sua regione extracellulare, alla presenilina nella sua regione transmembrana, e alla fosfora-ERM e alla z-actinina nella sua regione citoplasmica5,8,14,15 ,16. TLCN si lega al citoscheletro dell’actina attraverso il fosforo-ERM su punta di filopodia dendritica e di z-actininina nelle spine e negli alberi dendritici8,16.
Abbiamo dimostrato che la sovraespressione del TLCN ha migliorato la formazione di filopodi a dendritici e ha indotto la reversione delle spine alla filopodia10. La forma attiva costituiscista di ezrin legata alla regione citoplasmica TLCN e la formazione di filopodia dendritica migliorata8. Così, TLCN regola la formazione di filopodi dendritici attraverso proteine che legano l’atto. Esselens et al. ha dimostrato che le microsfere hanno indotto l’accumulo di TLCN sui neuroni coltivati17. Abbiamo dimostrato che le strutture della coppa fagocitica si sono formate sui dendriti neuronali intorno alle microsfere rivestite di VN in modo dipendente dalla TLCN15. Costituenti di filopodi dendritici sono simili a quelli della coppa fagocitica. È difficile raccogliere la filopodi dendritica, ma è relativamente più facile raccogliere la coppa fagocitica utilizzando microsfere magnetiche. Così, abbiamo sviluppato un metodo per purificare la coppa fagocitica invece di filopodia dendritica18. Qui, descriviamo il metodo di purificazione per la frazione dendritica ricca di filopodia.
Protocol
Representative Results
Discussion
Abbiamo sviluppato un metodo di purificazione per la frazione dendritica ricca di filopodia utilizzando affinità tra la molecola di adesione cellulare TLCN e la proteina matrice extracellulare vitronectina. Rispetto alla frazione PSD, potrebbe essere possibile identificare le proteine sinaptiche che agiscono sulla sinapsi immatura dalla frazione dendritica ricca di filopodia. Così, i costituenti della frazione dendritica ricca di filopodia sono diversi da quelli della frazione PSD del 74%. A differenza della frazione P…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo Shigeo Okabe e Hitomi Matsuno per la cultura a bassa densità dei neuroni ippocampali, Masayoshi Mishina per topi carenti di TLCN, Sachiko Mitsui e Momoko Shiozaki per l’assistenza tecnica, e membri del laboratorio Yoshihara per discussioni utili . Questo lavoro è stato supportato da JSPS KAKENHI Grant Nos. JP20700307, JP22700354 e JP24500392 e MEXT KAKENHI Grant Nos. da JP23123525 a YF e JP20022046, JP18H04683 e da JP18H05146 a YY.
Materials
| 1 M HEPES | Gibco | 15630-080 | |
| 1.7 ml Low Binding MCT | Sorenson BioScience | 39640T | |
| 200 mM L-Glutamine | Gibco | 2530149 | |
| 35-mm plastic cell culture dishes | Corning | 430165 | |
| Anti-actin | Sigma-Aldrich | A-5060 | |
| Anti-alpha-Actinin | Sigma-Aldrich | A-5044 | |
| Anti-alpha-tubulin | Sigma-Aldrich | T-9026 | |
| Anti-Ezrin | Sigma-Aldrich | clone3C12, SAB4200806 | |
| Anti-Galphaq | Santacruz | sc-393 | |
| Anti-MAP2 | Chemicon | clone AP20, MAB3418 | |
| Anti-Moesin | Sigma-Aldrich | clone 38/87, M7060 | |
| Anti-PLCbeta1 | Santacuz | sc-5291 | |
| Anti-PSD95 | MA2 | ABR | |
| Anti-Spectrin beta | Chemicon | MAB1622 | |
| B27 | Gibco | 0080085SA | |
| BCA protein assay kit | Thermo | 23227 | |
| Bromophenol blue | Merck | 1.08122.0005 | |
| calcium chrolide, hydrous | Wako | 038-19735 | |
| Cell scraper | Falcon | 353085 | |
| Cell strainer | Falcon | 352350 | |
| Choline chloride | Sigma-Aldrich | C7527 | |
| Complete EDTA free protease inhibitor cocktail | Roche | 11873580001 | |
| Cytosine beta-D-arabinofuranoside | Sigma-Aldrich | C-6645 | |
| DNase-I | Sigma-Aldrich | DN-25 | |
| D-Pantothenic acid hemicalcium salt | Sigma-Aldrich | P5155 | |
| DynaMag-2 Magnet | Thermo | 12321D | |
| ECL Prime Western Blotting Detection Reagent | GE | RPN2232 | |
| e-PAGEL 5-20% SDS-PAGE gradient gel | ATTO | E-T520L | |
| Folic acid | Sigma-Aldrich | F8758 | |
| HBSS | Gibco | 14175095 | |
| HRP-conjugated anti-rabbit IgG | Jackson ImmunoResearch | 111-035-144 | |
| i-Inositol | Sigma-Aldrich | I7508 | |
| LAS-1000 mini | Fuji Film | LAS-1000 mini | For detection of luminescence from WB membrane |
| Magnetic polystyrene microbeads | Sperotech | PM-20-10 | |
| MEM amino acid solution | Gibco | 11130-051 | 30 mM L-Arginine hydrochloride, 5 mM L-Cystine, 10 mM L-Histidine hydrochloride-H2O, 20 mM L-Isoleucine, 20 mM L-Leucine, 19.8 mM L-Lysine hydrochloride, 5.1 mM L-Methionine, 10 mM L-Phenylalanine, 20 mM L-Threonine, 2.5 mM L-Tryptophan, 10 mM L-Tyrosine, and 20 mM L-Valine |
| Mini-slab size electrophoresis system | ATTO | AE-6530 | |
| Niacinamide | Sigma-Aldrich | N0636 | |
| Penicilin / Streptomycin | Gibco | 15070063 | |
| PhosSTOP phosphatase inhibitor cocktail | Roche | 4906845001 | |
| Poly-L-lysine hydrobromide | Nacali | 28360-14 | |
| Pyridoxal HCl | Sigma-Aldrich | P6155 | |
| Riboflavin | Sigma-Aldrich | R9504 | |
| Silver Stain 2 Kit wako | Wako | 291-5031 | |
| Thiamine HCl | Sigma-Aldrich | T1270 | |
| Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer Cell | Bio-rad | 1703940JA | |
| Ultra pure water | MilliQ | For production of ultra pure water |
Riferimenti
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