樹状フィロポディアリッチ画の精製
Summary
このプロトコルでは、樹状性フィロポジア間の特異的かつ強い親和性を利用して、培養海馬ニューロン上の食中毒カップ様突起構造から樹状フィロポジアが豊富な画分を精製する方法を紹介する。接着分子、TLCN、および細胞外マトリックス分子、ビトロネクチン。
Abstract
樹状フィロポディアは、アクチンフィラメントに基づいて薄く長い突起であり、それらは、ターゲット軸を検索するかのように拡張し、後退します。樹状フィロポディアが標的軸線との接触を確立すると、それらは脊椎に成熟し始め、シナプスの形成につながる。テレンセファリン(TLCN)は樹状フィロポディアに豊富に局在し、徐々に脊椎から除外される。培養海馬ニューロンにおけるTLCNの過剰発現は、樹状性フィロポディア形成を誘導する。我々は、テレスファリンが細胞外マトリックス分子、ビトロネクチンに強く結合することを示した。ビトロネクチンコーティングマイクロビーズは、神経デンドライト上の食器細胞性カップ形成を誘発した。食細胞カップでは、TLCN、リン酸化エズリン/ラジキシン/モエシン(ホスホ-ERM)、F-アクチンなどのTLCN結合タンパク質が蓄積され、食中毒カップの成分が樹状フィロポディアのものと類似していることを示唆している。そこで、樹状フィロポディアの代わりに食細胞性カップを精製する方法を開発した。磁気ポリスチレンビーズは、海馬ニューロンの培養培地に豊富に存在し、神経デンドライト上の食細胞性カップ形成を誘導するビトロネクチンでコーティングされた。インキュベーションの24時間後、ファゴサイトカップを洗剤で軽度に可溶化し、磁石セパレータを用いて回収した。ビーズを洗浄した後、結合タンパク質をタンパク質をタンパク質をタンパク質をタンパク質でタンパク質にして、銀染色およびウェスタンブロッティングにより分析した。結合画分では、TLCNおよびアクチンが豊富に存在していた。さらに、画分から同定された多くのタンパク質は樹状フィロポディアに局在した。したがって、結合分数を樹状フィロポディアリッチ画として命名した。この記事では、樹状フィロポディアリッチ画の精製方法に関する詳細について説明します。
Introduction
樹状フィロポディアは脊椎の前駆体であると考えられている。樹状フィロポディアのアクチンフィラメントは、その延長と引き込みを調節する1,2,3.軸と接触した後、選択された樹状フィロポディアは脊椎に成熟を開始し、シナプスが形成され、4、5.脊椎の成分は、樹状密度画率6、7の包括的な分析から決定されたが、樹状フィロポディアの成分はほとんど知られていない。テレスファリン(TLCN)、ERM、SynGAP、Ras、PI3キナーゼ、Akt、mTOR、ポロ様キナーゼ2、CaMKII、シンデカン-2、パラレミン-1、ARF6、およびEphBBがデンドリックフィロポダイヤ形成5、8、9を調節することが示されている。 ,10,11, 樹状フィロポディアに存在する分子の包括的な分析のための方法が開発されていない間.
TLCN(ICAM-5)は、最もrostral脳セグメントにおける脊椎ニューロンによって特異的に発現され、テレスファロン12である。TLCNは、その細胞外領域に9つのIg様ドメイン、膜領域、および細胞質尾13を有する。TLCNは、その細胞外領域におけるビトロネクチン(VN)およびLFA-1インテグリンに結合し、その膜領域におけるプレセニリンに、そして細胞質領域5、8、14、15におけるホスホ-ERMおよびα-アクチニンに結合する。 、16.TLCNは、脊椎および樹状シャフト8、16の樹状フィロポディアおよびα-アクチニンの先端にリン-ERMを介してアクチン細胞骨格に結合する。
我々は、TLCNの過剰発現が樹状フィロポディア形成を増強し、フィロポディア10への脊椎の復帰を誘導することを示した。TLCN細胞質領域に結合したエズリンの構成活性形態と高められた樹状フィロポディア形成8.したがって、TLCNは、アクチン結合タンパク質を介して樹状フィロポディア形成を調節する。Esselensらは、マイクロビーズが培養ニューロン17にTLCN蓄積を誘導することを実証した。我々は、TNコーティングされたマイクロビーズの周りの神経デンドライト上に、TLCN依存的な方法15で食細胞性カップ構造が形成されることを示した。樹状フィロポディアの成分は、食中毒カップのものと類似しています。樹状フィロポディアを採取することは困難ですが、磁気マイクロビーズを使用して食中毒カップを収集することは比較的容易です。そこで、樹状フィロポディア18の代わりに食細胞性カップを精製する方法を開発した。ここでは、樹状フィロポディアが豊富な画分の精製方法について説明する。
Protocol
Representative Results
Discussion
細胞接着分子TLCNと細胞外マトリックスタンパク質ビトロネクチンとの親和性を用いた樹状フィロポディアリッチ画分の精製方法を開発した。PSD画分と比較して、樹状フィロポディアが豊富な画分から未熟なシナプスに作用するシナプスタンパク質を同定することができる。したがって、樹状フィロポディア富率の構成成分は、74%によってPSD画分のものと異なる。PSD分画とは異なり、培養海馬…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
海馬ニューロンの低密度培養に対する岡部茂雄氏と松野仁美さん、TLCN欠損マウスの三科正義さん、技術支援を受けた三井幸子さん、塩崎桃子さん、吉原研究室のメンバーに感謝の意を表します。.この作品は、JSPSカケンヒグラント・ノーズが支援しました。JP20700307、JP22700354、JP24500392、文部研日グラントNos.JP23123525からYFおよびJP20022046、JP18H04683、およびJP18H05146からYYへ。
Materials
| 1 M HEPES | Gibco | 15630-080 | |
| 1.7 ml Low Binding MCT | Sorenson BioScience | 39640T | |
| 200 mM L-Glutamine | Gibco | 2530149 | |
| 35-mm plastic cell culture dishes | Corning | 430165 | |
| Anti-actin | Sigma-Aldrich | A-5060 | |
| Anti-alpha-Actinin | Sigma-Aldrich | A-5044 | |
| Anti-alpha-tubulin | Sigma-Aldrich | T-9026 | |
| Anti-Ezrin | Sigma-Aldrich | clone3C12, SAB4200806 | |
| Anti-Galphaq | Santacruz | sc-393 | |
| Anti-MAP2 | Chemicon | clone AP20, MAB3418 | |
| Anti-Moesin | Sigma-Aldrich | clone 38/87, M7060 | |
| Anti-PLCbeta1 | Santacuz | sc-5291 | |
| Anti-PSD95 | MA2 | ABR | |
| Anti-Spectrin beta | Chemicon | MAB1622 | |
| B27 | Gibco | 0080085SA | |
| BCA protein assay kit | Thermo | 23227 | |
| Bromophenol blue | Merck | 1.08122.0005 | |
| calcium chrolide, hydrous | Wako | 038-19735 | |
| Cell scraper | Falcon | 353085 | |
| Cell strainer | Falcon | 352350 | |
| Choline chloride | Sigma-Aldrich | C7527 | |
| Complete EDTA free protease inhibitor cocktail | Roche | 11873580001 | |
| Cytosine beta-D-arabinofuranoside | Sigma-Aldrich | C-6645 | |
| DNase-I | Sigma-Aldrich | DN-25 | |
| D-Pantothenic acid hemicalcium salt | Sigma-Aldrich | P5155 | |
| DynaMag-2 Magnet | Thermo | 12321D | |
| ECL Prime Western Blotting Detection Reagent | GE | RPN2232 | |
| e-PAGEL 5-20% SDS-PAGE gradient gel | ATTO | E-T520L | |
| Folic acid | Sigma-Aldrich | F8758 | |
| HBSS | Gibco | 14175095 | |
| HRP-conjugated anti-rabbit IgG | Jackson ImmunoResearch | 111-035-144 | |
| i-Inositol | Sigma-Aldrich | I7508 | |
| LAS-1000 mini | Fuji Film | LAS-1000 mini | For detection of luminescence from WB membrane |
| Magnetic polystyrene microbeads | Sperotech | PM-20-10 | |
| MEM amino acid solution | Gibco | 11130-051 | 30 mM L-Arginine hydrochloride, 5 mM L-Cystine, 10 mM L-Histidine hydrochloride-H2O, 20 mM L-Isoleucine, 20 mM L-Leucine, 19.8 mM L-Lysine hydrochloride, 5.1 mM L-Methionine, 10 mM L-Phenylalanine, 20 mM L-Threonine, 2.5 mM L-Tryptophan, 10 mM L-Tyrosine, and 20 mM L-Valine |
| Mini-slab size electrophoresis system | ATTO | AE-6530 | |
| Niacinamide | Sigma-Aldrich | N0636 | |
| Penicilin / Streptomycin | Gibco | 15070063 | |
| PhosSTOP phosphatase inhibitor cocktail | Roche | 4906845001 | |
| Poly-L-lysine hydrobromide | Nacali | 28360-14 | |
| Pyridoxal HCl | Sigma-Aldrich | P6155 | |
| Riboflavin | Sigma-Aldrich | R9504 | |
| Silver Stain 2 Kit wako | Wako | 291-5031 | |
| Thiamine HCl | Sigma-Aldrich | T1270 | |
| Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer Cell | Bio-rad | 1703940JA | |
| Ultra pure water | MilliQ | For production of ultra pure water |
Riferimenti
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