Summary
I denne protokollen introduserer vi en metode for rensing av dendrittiske filopodia fraksjon fra phagocytic Cup-lignende protrusion struktur på kultivert hippocampus neurons ved å utnytte den spesifikke og sterke affinitet mellom en dendrittiske filopodial vedheft molekyl, TLCN, og en ekstracellulære matrise molekyl, vitronectin.
Abstract
Dendrittiske filopodia er tynne og lange utstikkende basert på utgangen filament, og de strekker og trekker seg som om du søker etter et mål axon. Når dendrittiske filopodia etablere kontakt med en mål axon, begynner de å modnes i pigger, noe som fører til dannelsen av en synapse. Telencephalin (TLCN) er rikelig lokalisert i dendrittiske filopodia og blir gradvis ekskludert fra pigger. Overuttrykte av TLCN i kultivert hippocampus neurons induserer dendrittiske filopodia formasjon. Vi viste at telencephalin sterkt binder seg til en ekstracellulære matrise molekyl, vitronectin. Vitronectin-belagt mikroperler indusert phagocytic kopp formasjon på neuronal dendrites. I phagocytic Cup, TLCN, TLCN-bindende proteiner som fosforylert Ezrin/Radixin/Moesin (fosfat-ERM), og F-utgangen er akkumulert, noe som tyder på at komponentene i phagocytic koppen er lik de av dendrittiske filopodia. Derfor utviklet vi en metode for rensing av phagocytic koppen i stedet for dendrittiske filopodia. Magnetiske polystyren perler var belagt med vitronectin, som er rikelig til stede i kulturen medium for hippocampus neurons og som induserer phagocytic kopp formasjon på neuronal dendrites. Etter 24 h av inkubasjons, phagocytic koppene var mildt solubilized med vaskemiddel og samlet inn ved hjelp av en magnet separator. Etter vask av perlene, ble de bindende proteinene eluert og analysert av sølv flekker og vestlig blotting. I bindingen brøk, TLCN og utgangen var rikelig til stede. I tillegg ble mange proteiner identifisert fra fraksjonen lokalisert til dendrittiske filopodia; dermed kalte vi bindingen brøk som dendrittiske filopodia-rik brøk. Denne artikkelen beskriver detaljer om rensing metoden for dendrittiske filopodia-rik brøk.
Introduction
Dendrittiske filopodia antas å være forløpere for pigger. Utgangen filamenter i dendrittiske filopodia regulere sin forlengelse og uttrekk1,2,3. Etter å ha kontaktet en axon, valgte dendrittiske filopodia begynne sin modning i pigger, og en synapse er dannet4,5. Komponenter av pigger har blitt bestemt fra omfattende analyse av postsynaptic tetthet fraksjoner6,7, mens komponenter av dendrittiske filopodia fortsatt i stor grad ukjent. Det har blitt vist at telencephalin (TLCN), erm, SynGAP, RAS, PI3 kinase, akt, mTOR, Polo-like kinase 2, CaMKII, syndecan-2, paralemin-1, ARF6, og EphB regulere dendrittiske filopodia formasjon5,8,9 ,10,11, mens en metode ikke er utviklet for den omfattende analyse av molekyler til stede i dendrittiske filopodia.
TLCN (ICAM-5) er spesielt uttrykt ved spiny neurons i de mest rostral hjernen segmentet, Telencephalon12. TLCN har 9 IG-lignende domener i sin ekstracellulære region, en transmembrane region, og en cytoplasmatiske hale13. TLCN binder seg til vitronectin (vn) og LFA-1 integrin i sin ekstracellulære region, til presenilin i sin transmembrane region, og til fosfat-erm og α-actinin i sin cytoplasmatiske region5,8,14,15 ,16. TLCN binder seg til utgangen cytoskeleton gjennom fosfat-erm på tuppen av dendrittiske filopodia og α-actinin i pigger og dendrittiske aksler8,16.
Vi viste at overuttrykte av TLCN forbedret dendrittiske filopodia formasjon og indusert reversion av pigger til filopodia10. Den konstituerende aktive formen av Ezrin bundet til TLCN cytoplasmatiske regionen og forbedret dendrittiske filopodia formasjon8. Således regulerer TLCN dendrittiske filopodia formasjon gjennom utgangen-bindende proteiner. Esselens et al. demonstrerte at mikroperler indusert TLCN akkumulering på kultivert neurons17. Vi viste at phagocytic Cup strukturer ble dannet på neuronal dendrites rundt VN-belagt mikroperler i en TLCN-avhengig måte15. Bestanddeler av dendrittiske filopodia er lik de av phagocytic koppen. Det er vanskelig å samle dendrittiske filopodia, men det er relativt lettere å samle phagocytic koppen ved hjelp av magnetisk mikroperler. Dermed har vi utviklet en metode for å rense phagocytic koppen i stedet for dendrittiske filopodia18. Her beskriver vi rensing metoden for dendrittiske filopodia-rik brøk.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vi utviklet en rensing metode for dendrittiske filopodia-rike brøkdel ved hjelp av affinitet mellom celle vedheft molekylet TLCN og ekstracellulære Matrix protein vitronectin. Sammenlignet med PSD brøkdel, kan det være mulig å identifisere Synaptic proteiner opptrer på umodne synapse fra dendrittiske filopodia-rik brøk. Dermed er bestanddelene av dendrittiske filopodia-rik brøk er forskjellig fra de av PSD brøkdel av 74%. Forskjellig fra PSD brøkdel, brukte vi kultivert hippocampus neurons å aktivt danne phago…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Shigeo Okabe og Hitomi Matsuno for lav tetthet kultur hippocampus neurons, Masayoshi Mishina for TLCN-mangelfull mus, Sachiko Mitsui og Momoko Shiozaki for teknisk assistanse, og medlemmer av Yoshihara laboratoriet for nyttige diskusjoner . Dette arbeidet ble støttet av JSP KAKENHI Grant NOS. JP20700307, JP22700354 og JP24500392 og MEXT KAKENHI Grant NOS. JP23123525 til YF og JP20022046, JP18H04683 og JP18H05146 til åå.
Materials
| 1 M HEPES | Gibco | 15630-080 | |
| 1.7 ml Low Binding MCT | Sorenson BioScience | 39640T | |
| 200 mM L-Glutamine | Gibco | 2530149 | |
| 35-mm plastic cell culture dishes | Corning | 430165 | |
| Anti-actin | Sigma-Aldrich | A-5060 | |
| Anti-alpha-Actinin | Sigma-Aldrich | A-5044 | |
| Anti-alpha-tubulin | Sigma-Aldrich | T-9026 | |
| Anti-Ezrin | Sigma-Aldrich | clone3C12, SAB4200806 | |
| Anti-Galphaq | Santacruz | sc-393 | |
| Anti-MAP2 | Chemicon | clone AP20, MAB3418 | |
| Anti-Moesin | Sigma-Aldrich | clone 38/87, M7060 | |
| Anti-PLCbeta1 | Santacuz | sc-5291 | |
| Anti-PSD95 | MA2 | ABR | |
| Anti-Spectrin beta | Chemicon | MAB1622 | |
| B27 | Gibco | 0080085SA | |
| BCA protein assay kit | Thermo | 23227 | |
| Bromophenol blue | Merck | 1.08122.0005 | |
| calcium chrolide, hydrous | Wako | 038-19735 | |
| Cell scraper | Falcon | 353085 | |
| Cell strainer | Falcon | 352350 | |
| Choline chloride | Sigma-Aldrich | C7527 | |
| Complete EDTA free protease inhibitor cocktail | Roche | 11873580001 | |
| Cytosine beta-D-arabinofuranoside | Sigma-Aldrich | C-6645 | |
| DNase-I | Sigma-Aldrich | DN-25 | |
| D-Pantothenic acid hemicalcium salt | Sigma-Aldrich | P5155 | |
| DynaMag-2 Magnet | Thermo | 12321D | |
| ECL Prime Western Blotting Detection Reagent | GE | RPN2232 | |
| e-PAGEL 5-20% SDS-PAGE gradient gel | ATTO | E-T520L | |
| Folic acid | Sigma-Aldrich | F8758 | |
| HBSS | Gibco | 14175095 | |
| HRP-conjugated anti-rabbit IgG | Jackson ImmunoResearch | 111-035-144 | |
| i-Inositol | Sigma-Aldrich | I7508 | |
| LAS-1000 mini | Fuji Film | LAS-1000 mini | For detection of luminescence from WB membrane |
| Magnetic polystyrene microbeads | Sperotech | PM-20-10 | |
| MEM amino acid solution | Gibco | 11130-051 | 30 mM L-Arginine hydrochloride, 5 mM L-Cystine, 10 mM L-Histidine hydrochloride-H2O, 20 mM L-Isoleucine, 20 mM L-Leucine, 19.8 mM L-Lysine hydrochloride, 5.1 mM L-Methionine, 10 mM L-Phenylalanine, 20 mM L-Threonine, 2.5 mM L-Tryptophan, 10 mM L-Tyrosine, and 20 mM L-Valine |
| Mini-slab size electrophoresis system | ATTO | AE-6530 | |
| Niacinamide | Sigma-Aldrich | N0636 | |
| Penicilin / Streptomycin | Gibco | 15070063 | |
| PhosSTOP phosphatase inhibitor cocktail | Roche | 4906845001 | |
| Poly-L-lysine hydrobromide | Nacali | 28360-14 | |
| Pyridoxal HCl | Sigma-Aldrich | P6155 | |
| Riboflavin | Sigma-Aldrich | R9504 | |
| Silver Stain 2 Kit wako | Wako | 291-5031 | |
| Thiamine HCl | Sigma-Aldrich | T1270 | |
| Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer Cell | Bio-rad | 1703940JA | |
| Ultra pure water | MilliQ | For production of ultra pure water |
Riferimenti
- Fiala, J. C., Feinberg, M., Popov, V., Harris, K. M. Synaptogenesis via dendritic filopodia in developing hippocampal area CA1. Journal of Neuroscience. 18 (21), 8900-8911 (1998).
- Portera-Cailliau, C., Pan, D. T., Yuste, R. Activity-regulated dynamic behavior of early dendritic protrusions: evidence for different types of dendritic filopodia. Journal of Neuroscience. 23 (18), 7129-7142 (2003).
- Ziv, N. E., Smith, S. J. Evidence for a role of dendritic filopodia in synaptogenesis and spine formation. Neuron. 17 (1), 91-102 (1996).
- Lohmann, C., Bonhoeffer, T. A role for local calcium signaling in rapid synaptic partner selection by dendritic filopodia. Neuron. 59 (2), 253-260 (2008).
- Yoshihara, Y., De Roo, M., Muller, D. Dendritic spine formation and stabilization. Current Opinion in Neurobiology. 19 (2), 146-153 (2009).
- Bayes, A., et al. Comparative study of human and mouse postsynaptic proteomes finds high compositional conservation and abundance differences for key synaptic proteins. PLoS One. 7 (10), e46683 (2012).
- Bayes, A., et al. Characterization of the proteome, diseases and evolution of the human postsynaptic density. Nature Neuroscience. 14 (1), 19-21 (2011).
- Furutani, Y., et al. Interaction between telencephalin and ERM family proteins mediates dendritic filopodia formation. Journal of Neuroscience. 27 (33), 8866-8876 (2007).
- Mao, Y. T., et al. Filopodia Conduct Target Selection in Cortical Neurons Using Differences in Signal Kinetics of a Single Kinase. Neuron. 98 (4), 767-782 (2018).
- Matsuno, H., et al. Telencephalin slows spine maturation. Journal of Neuroscience. 26 (6), 1776-1786 (2006).
- Raemaekers, T., et al. ARF6-mediated endosomal transport of Telencephalin affects dendritic filopodia-to-spine maturation. The EMBO Journal. 31 (15), 3252-3269 (2012).
- Mori, K., Fujita, S. C., Watanabe, Y., Obata, K., Hayaishi, O. Telencephalon-specific antigen identified by monoclonal antibody. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 84 (11), 3921-3925 (1987).
- Yoshihara, Y., Mori, K. Telencephalin: a neuronal area code molecule?. Neuroscience Research. 21 (2), 119-124 (1994).
- Annaert, W. G., et al. Interaction with telencephalin and the amyloid precursor protein predicts a ring structure for presenilins. Neuron. 32 (4), 579-589 (2001).
- Furutani, Y., et al. Vitronectin induces phosphorylation of ezrin/radixin/moesin actin-binding proteins through binding to its novel neuronal receptor telencephalin. Journal of Biological Chemistry. 287 (46), 39041-39049 (2012).
- Nyman-Huttunen, H., Tian, L., Ning, L., Gahmberg, C. G. alpha-Actinin-dependent cytoskeletal anchorage is important for ICAM-5-mediated neuritic outgrowth. Journal of Cell Biology. 119 (Pt 15), 3057-3066 (2006).
- Esselens, C., et al. Presenilin 1 mediates the turnover of telencephalin in hippocampal neurons via an autophagic degradative pathway. Journal of Cell Biology. 166 (7), 1041-1054 (2004).
- Furutani, Y., Yoshihara, Y. Proteomic Analysis of Dendritic Filopodia-Rich Fraction Isolated by Telencephalin and Vitronectin Interaction. Frontiers in Synaptic Neuroscience. 10, 27 (2018).
- Lu, Z., Piechowicz, M., Qiu, S. A Simplified Method for Ultra-Low Density, Long-Term Primary Hippocampal Neuron Culture. Journal of Visualized Experiments. (109), (2016).
- Okabe, S., Miwa, A., Okado, H. Alternative splicing of the C-terminal domain regulates cell surface expression of the NMDA receptor NR1 subunit. The Journal of Neuroscience. 19 (18), 7781-7792 (1999).
- Okabe, S., Vicario-Abejon, C., Segal, M., McKay, R. D. Survival and synaptogenesis of hippocampal neurons without NMDA receptor function in culture. European Journal of Neuroscience. 10 (6), 2192-2198 (1998).
