Purificación de la fracción defípoda dendrítica
Summary
En este protocolo, introducimos un método para purificar la fracción dendrítica rica en filopodia a partir de la estructura de protrusión phagocítica similar a la copa en las neuronas del hipocampo cultivadas aprovechando la afinidad específica y fuerte entre un filopodial dendrítico molécula de adhesión, TLCN, y una molécula de matriz extracelular, vitroctina.
Abstract
La filopodia dendrítica son protuberancias delgadas y largas basadas en el filamento de actina, y se extienden y se retraen como si buscaran un axón objetivo. Cuando la filopodia dendrítica establece contacto con un axón objetivo, comienzan a madurar en espinas, lo que conduce a la formación de una sinapsis. La telencefalina (TLCN) se localiza abundantemente en filopodia dendrítica y se excluye gradualmente de las espinas. La sobreexpresión de TLCN en neuronas hipocampales cultivadas induce la formación de filopodia dendrítica. Mostramos que la telencefalia se une fuertemente a una molécula de matriz extracelular, vitronectina. Microperlas de Vitronectina inducida por la formación de copas fagocíticas en dendritas neuronales. En la copa fagocítica, se acumulan TLCN, proteínas de unión a TLCN como Ezrin/Radixin/Moesin(phospho-ERM) foso-ERM, y F-actina, lo que sugiere que los componentes de la copa fagocítica son similares a los de la filopodia dendrítica. Por lo tanto, desarrollamos un método para purificar la copa fagocítica en lugar de filopodia dendrítica. Las perlas de poliestireno magnético fueron recubiertas con vitronectina, que está abundantemente presente en el medio de cultivo de las neuronas del hipocampo y que induce la formación de copas fagocíticas en dendritas neuronales. Después de 24 horas de incubación, las copas fagocíticas fueron ligeramente solubilizadas con detergente y recogidas con un separador de imán. Después de lavar las cuentas, las proteínas de unión fueron eluidas y analizadas por la tinción de plata y la hincha occidental. En la fracción de unión, TLCN y actina estaban abundantemente presentes. Además, muchas proteínas identificadas a partir de la fracción fueron localizadas a la filopodia dendrítica; por lo tanto, nombramos la fracción de unión como la fracción dendrítica rica en filopodia. Este artículo describe los detalles sobre el método de purificación para la fracción dendrítica rica en filopodia.
Introduction
Filopodia dendrítica se cree que son precursores de las espinas. Los filamentos de actina en la filopodia dendrítica regulan su extensión y retracción1,2,3. Después de entrar en contacto con un axón, la filopodia dendrítica seleccionada comienza su maduración en espinas, y se forma una sinapsis4,5. Los componentes de las espinas se han determinado a partir de un análisis exhaustivo de las fracciones de densidad postsináptica6,7, mientras que los componentes de la filopodia dendrítica siguen siendo en gran medida desconocidos. Se ha demostrado que la telencefalina (TLCN), ERM, SynGAP, Ras, PI3 quinasa, Akt, mTOR, polo-como quinasa 2, CaMKII, syndecan-2, paralemin-1, ARF6, y EphB regulan la formación de filopodia dendrítica5,8,9 ,10,11, mientras que no se ha desarrollado un método para el análisis integral de moléculas presentes en la filopodia dendrítica.
TLCN (ICAM-5) se expresa específicamente por las neuronas espinosas en el segmento cerebral más rostral, el telencéfalo12. TLCN tiene 9 dominios similares a Ig en su región extracelular, una región transmembrana y una cola citoplasmática13. EL TLCN se une a vitronectina (VN) y a la integrina LFA-1 en su región extracelular, a la presenilinicina ensu región transmembrana, y a la fosfo-ERM y a la actina en su región citoplasmática 5,8,14,15 ,16. El TLCN se une al citoesqueleto de actina a través de fosfo-ERM en las puntas de filopodia dendrítica y de actinina en espinas y ejes dendríticos8,16.
Mostramos que la sobreexpresión de TLCN mejoró la formación de filopodia dendrítica e indujo la reversión de las espinas a la filopodia10. La forma activa constitutiva de ezrin ligada a la región citoplasmática TLCN y la formación de filopodia dendrítica mejorada8. Por lo tanto, TLCN regula la formación de filopodia dendrítica a través de proteínas de unión a la actina. Esselens y otros demostraron que las microperlas indujeron la acumulación de TLCN en las neuronas cultivadas17. Mostramos que las estructuras de copa shagocíticas se formaron sobre dendritas neuronales alrededor de microperlas recubiertas de VN de una manera dependiente del TLCN15. Los componentes de la filopodia dendrítica son similares a los de la copa fagocítica. Es difícil recoger filopodia dendrítica, pero es relativamente más fácil recoger la copa fagocítica usando microperlas magnéticas. Así, desarrollamos un método para purificar la copa fagocítica en lugar de la filopodia dendrítica18. Aquí, describimos el método de purificación para la fracción dendrítica rica en filopodia.
Protocol
Representative Results
Discussion
Desarrollamos un método de purificación para la fracción dendrítica rica en filopodia utilizando la afinidad entre la molécula de adhesión celular TLCN y la matriz extracelular profisitecina. En comparación con la fracción de PSD, podría ser posible identificar las proteínas sinápticas que actúan sobre la sinapsis inmadura de la fracción dendritica rica en filopodia. Por lo tanto, los componentes de la fracción dendrítica rica en filopodia son diferentes de los de la fracción PSD por 74%. A diferencia de …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a Shigeo Okabe y Hitomi Matsuno por la cultura de baja densidad de las neuronas hipocampales, Masayoshi Mishina por ratones con deficiencia de TLCN, Sachiko Mitsui y Momoko Shiozaki por la asistencia técnica, y miembros del laboratorio Yoshihara para discusiones útiles . Este trabajo fue apoyado por JSPS KAKENHI Grant Nos. JP20700307, JP22700354, y JP24500392 y MEXT KAKENHI Grant Nos. JP23123525 a YF y JP20022046, JP18H04683 y JP18H05146 a YY.
Materials
| 1 M HEPES | Gibco | 15630-080 | |
| 1.7 ml Low Binding MCT | Sorenson BioScience | 39640T | |
| 200 mM L-Glutamine | Gibco | 2530149 | |
| 35-mm plastic cell culture dishes | Corning | 430165 | |
| Anti-actin | Sigma-Aldrich | A-5060 | |
| Anti-alpha-Actinin | Sigma-Aldrich | A-5044 | |
| Anti-alpha-tubulin | Sigma-Aldrich | T-9026 | |
| Anti-Ezrin | Sigma-Aldrich | clone3C12, SAB4200806 | |
| Anti-Galphaq | Santacruz | sc-393 | |
| Anti-MAP2 | Chemicon | clone AP20, MAB3418 | |
| Anti-Moesin | Sigma-Aldrich | clone 38/87, M7060 | |
| Anti-PLCbeta1 | Santacuz | sc-5291 | |
| Anti-PSD95 | MA2 | ABR | |
| Anti-Spectrin beta | Chemicon | MAB1622 | |
| B27 | Gibco | 0080085SA | |
| BCA protein assay kit | Thermo | 23227 | |
| Bromophenol blue | Merck | 1.08122.0005 | |
| calcium chrolide, hydrous | Wako | 038-19735 | |
| Cell scraper | Falcon | 353085 | |
| Cell strainer | Falcon | 352350 | |
| Choline chloride | Sigma-Aldrich | C7527 | |
| Complete EDTA free protease inhibitor cocktail | Roche | 11873580001 | |
| Cytosine beta-D-arabinofuranoside | Sigma-Aldrich | C-6645 | |
| DNase-I | Sigma-Aldrich | DN-25 | |
| D-Pantothenic acid hemicalcium salt | Sigma-Aldrich | P5155 | |
| DynaMag-2 Magnet | Thermo | 12321D | |
| ECL Prime Western Blotting Detection Reagent | GE | RPN2232 | |
| e-PAGEL 5-20% SDS-PAGE gradient gel | ATTO | E-T520L | |
| Folic acid | Sigma-Aldrich | F8758 | |
| HBSS | Gibco | 14175095 | |
| HRP-conjugated anti-rabbit IgG | Jackson ImmunoResearch | 111-035-144 | |
| i-Inositol | Sigma-Aldrich | I7508 | |
| LAS-1000 mini | Fuji Film | LAS-1000 mini | For detection of luminescence from WB membrane |
| Magnetic polystyrene microbeads | Sperotech | PM-20-10 | |
| MEM amino acid solution | Gibco | 11130-051 | 30 mM L-Arginine hydrochloride, 5 mM L-Cystine, 10 mM L-Histidine hydrochloride-H2O, 20 mM L-Isoleucine, 20 mM L-Leucine, 19.8 mM L-Lysine hydrochloride, 5.1 mM L-Methionine, 10 mM L-Phenylalanine, 20 mM L-Threonine, 2.5 mM L-Tryptophan, 10 mM L-Tyrosine, and 20 mM L-Valine |
| Mini-slab size electrophoresis system | ATTO | AE-6530 | |
| Niacinamide | Sigma-Aldrich | N0636 | |
| Penicilin / Streptomycin | Gibco | 15070063 | |
| PhosSTOP phosphatase inhibitor cocktail | Roche | 4906845001 | |
| Poly-L-lysine hydrobromide | Nacali | 28360-14 | |
| Pyridoxal HCl | Sigma-Aldrich | P6155 | |
| Riboflavin | Sigma-Aldrich | R9504 | |
| Silver Stain 2 Kit wako | Wako | 291-5031 | |
| Thiamine HCl | Sigma-Aldrich | T1270 | |
| Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer Cell | Bio-rad | 1703940JA | |
| Ultra pure water | MilliQ | For production of ultra pure water |
Riferimenti
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