Reinigung der dendritischen Filopodia-reichen Fraktion
Summary
In diesem Protokoll führen wir eine Methode zur Reinigung der dendritischen filopodiareichen Fraktion aus der phagozytischen Cup-ähnlichen Vorsprungstruktur auf kultivierten Hippocampus-Neuronen ein, indem wir die spezifische und starke Affinität zwischen einem dendritischen Filopodialen Adhäsionsmolekül, TLCN, und ein extrazelluläres Matrixmolekül, vitronectin.
Abstract
Dendritische Filopodia sind dünne und lange Vorsprünge, die auf dem Actin-Filament basieren, und sie dehnen sich aus und ziehen sich zurück, als ob sie nach einem Zielaxon suchen. Wenn die dendritischen Filopodia Kontakt mit einem Zielaxon herstellen, beginnen sie, zu Stacheln zu reifen, was zur Bildung einer Synapse führt. Telencephalin (TLCN) ist reichlich in dendritischen Filopodien lokalisiert und wird nach und nach von Stacheln ausgeschlossen. Die Überexpression von TLCN in kultivierten Hippocampus-Neuronen induziert die dendritische Filopodia-Bildung. Wir zeigten, dass Telencephalin stark an ein extrazelluläres Matrixmolekül, vitronectin, bindet. Vitronectin-beschichtete Mikroperlen induzierten phagozytische Tasse Bildung auf neuronalen Dendriten. In der phagozytischen Tasse, TLCN, TLCN-bindende Proteine wie phosphorylierte Sezrin/Radixin/Moesin (Phospho-ERM), und F-Actin sind angesammelt, was darauf hindeutet, dass Komponenten der phagozytischen Tasse denen der dendritischen Filopodia ähneln. So entwickelten wir eine Methode zur Reinigung der phagozytischen Tasse anstelle der dendritischen Filopodia. Magnetische Polystyrolperlen wurden mit Vitronectin beschichtet, das im Kulturmedium der Hippocampus-Neuronen reichlich vorhanden ist und phagozytische Becherbildung bei neuronalen Dendriten induziert. Nach 24 h Inkubation wurden die phagozytischen Becher leicht mit Waschmittel verwoben und mit einem Magnetabscheider gesammelt. Nach dem Waschen der Perlen wurden die Bindungsproteine eluiert und durch Silberfärbung und Western-Blotting analysiert. In der Bindungsfraktion waren TLCN und Actin reichlich vorhanden. Darüber hinaus wurden viele Proteine, die aus der Fraktion identifiziert wurden, auf die dendritische Filopodia lokalisiert; Daher nannten wir die Bindungsfraktion die dendritische filopodiareiche Fraktion. Dieser Artikel beschreibt Details über die Reinigungsmethode für die dendritische filopodiareiche Fraktion.
Introduction
Dendritische Filopodia werden als Vorläufer von Stacheln angenommen. Actin Filamente in der dendritischen Filopodia regulieren ihre Ausdehnung und Rückzug1,2,3. Nach Kontakt mit einem Axon beginnen ausgewählte dendritische Filopodien ihre Reifung in Stacheln, und eine Synapse wirdgebildet 4,5. Komponenten der Stacheln wurden aus einer umfassenden Analyse der postsynaptischen Dichtefraktionen6,7bestimmt, während Komponenten der dendritischen Filopodia weitgehend unbekannt bleiben. Es hat sich gezeigt, dass Telencephalin (TLCN), ERM, SynGAP, Ras, PI3 Kinase, Akt, mTOR, Polo-ähnliche Kinase 2, CaMKII, Syndecan-2, Paralemin-1, ARF6 und EphB die dendritische Filopodiabildung regulieren5,8,9 ,10,11, während eine Methode für die umfassende Analyse von Molekülen in der dendritischen Filopodia nicht entwickelt wurde.
TLCN (ICAM-5) wird speziell durch stachelige Neuronen im rostralsten Hirnsegment, dem Telencephalon12,exprimiert. TLCN hat 9 Ig-ähnliche Domänen in seiner extrazellulären Region, eine Transmembranregion und einen zytoplasmatischen Schwanz13. TLCN bindet in seiner extrazellulären Region an Vitronectin (VN) und LFA-1-Integrin, an Presenilin in seiner Transmembranregion und an Phospho-ERM und -Actinin in seiner zytoplasmatischen Region5,8,14,15 ,16. TLCN bindet an das Aktin-Zytoskelett durch Phospho-ERM an den Spitzen der dendritischen Filopodia und des Actinins in Stacheln und dendritischen Wellen8,16.
Wir zeigten, dass die Überexpression der TLCN-verstärkten dendritischen Filopodia-Bildung und die Umkehrung der Wirbelsäule zu Filopodia10induzierte. Die konstitutive aktive Form von Ezrin, die an die tLCN-Zytoplasma-Region gebunden ist, und verbesserte dendritische Filopodia-Bildung8. So reguliert TLCN die dendritische Filopodiabildung durch aktinbindende Proteine. Esselens et al. zeigten, dass Mikroperlen die TLCN-Akkumulation an kultivierten Neuronen17induzierten. Wir zeigten, dass phagozytische Becherstrukturen auf neuronalen Dendriten um VN-beschichtete Mikroperlen in einer TLCN-abhängigen Weise gebildet wurden15. Bestandteile der dendritischen Filopodia ähneln denen der phagozytischen Tasse. Es ist schwierig, dendritische Filopodia zu sammeln, aber es ist relativ einfacher, die phagozytische Tasse mit magnetischen Mikroperlen zu sammeln. So haben wir eine Methode entwickelt, um den phagozytischen Becher anstelle der dendritischen Filopodia18zu reinigen. Hier beschreiben wir die Reinigungsmethode für die dendritische filopodiareiche Fraktion.
Protocol
Representative Results
Discussion
Wir entwickelten eine Reinigungsmethode für die dendritische filopodiareiche Fraktion unter Verwendung einer Affinität zwischen dem Zelladhäsionsmolekül TLCN und dem extrazellulären Matrixprotein vitronectin. Im Vergleich zur PSD-Fraktion könnte es möglich sein, die synaptischen Proteine, die auf die unreife Synapse wirken, aus der dendritischen filopodiareichen Fraktion zu identifizieren. So unterscheiden sich die Bestandteile der dendritischen filopodiareichen Fraktion um 74% von denen der PSD-Fraktion. Anders a…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Shigeo Okabe und Hitomi Matsuno für die Low-Density-Kultur der Hippocampus-Neuronen, Masayoshi Mishina für TLCN-mäuse, Sachiko Mitsui und Momoko Shiozaki für technische Hilfe und Mitglieder des Yoshihara-Labors für hilfreiche Diskussionen . Diese Arbeit wurde von JSPS KAKENHI Grant Nos unterstützt. JP20700307, JP22700354 und JP24500392 und MEXT KAKENHI Grant Nos. JP23123525 auf YF und JP20022046, JP18H04683 und JP18H05146 zu YY.
Materials
| 1 M HEPES | Gibco | 15630-080 | |
| 1.7 ml Low Binding MCT | Sorenson BioScience | 39640T | |
| 200 mM L-Glutamine | Gibco | 2530149 | |
| 35-mm plastic cell culture dishes | Corning | 430165 | |
| Anti-actin | Sigma-Aldrich | A-5060 | |
| Anti-alpha-Actinin | Sigma-Aldrich | A-5044 | |
| Anti-alpha-tubulin | Sigma-Aldrich | T-9026 | |
| Anti-Ezrin | Sigma-Aldrich | clone3C12, SAB4200806 | |
| Anti-Galphaq | Santacruz | sc-393 | |
| Anti-MAP2 | Chemicon | clone AP20, MAB3418 | |
| Anti-Moesin | Sigma-Aldrich | clone 38/87, M7060 | |
| Anti-PLCbeta1 | Santacuz | sc-5291 | |
| Anti-PSD95 | MA2 | ABR | |
| Anti-Spectrin beta | Chemicon | MAB1622 | |
| B27 | Gibco | 0080085SA | |
| BCA protein assay kit | Thermo | 23227 | |
| Bromophenol blue | Merck | 1.08122.0005 | |
| calcium chrolide, hydrous | Wako | 038-19735 | |
| Cell scraper | Falcon | 353085 | |
| Cell strainer | Falcon | 352350 | |
| Choline chloride | Sigma-Aldrich | C7527 | |
| Complete EDTA free protease inhibitor cocktail | Roche | 11873580001 | |
| Cytosine beta-D-arabinofuranoside | Sigma-Aldrich | C-6645 | |
| DNase-I | Sigma-Aldrich | DN-25 | |
| D-Pantothenic acid hemicalcium salt | Sigma-Aldrich | P5155 | |
| DynaMag-2 Magnet | Thermo | 12321D | |
| ECL Prime Western Blotting Detection Reagent | GE | RPN2232 | |
| e-PAGEL 5-20% SDS-PAGE gradient gel | ATTO | E-T520L | |
| Folic acid | Sigma-Aldrich | F8758 | |
| HBSS | Gibco | 14175095 | |
| HRP-conjugated anti-rabbit IgG | Jackson ImmunoResearch | 111-035-144 | |
| i-Inositol | Sigma-Aldrich | I7508 | |
| LAS-1000 mini | Fuji Film | LAS-1000 mini | For detection of luminescence from WB membrane |
| Magnetic polystyrene microbeads | Sperotech | PM-20-10 | |
| MEM amino acid solution | Gibco | 11130-051 | 30 mM L-Arginine hydrochloride, 5 mM L-Cystine, 10 mM L-Histidine hydrochloride-H2O, 20 mM L-Isoleucine, 20 mM L-Leucine, 19.8 mM L-Lysine hydrochloride, 5.1 mM L-Methionine, 10 mM L-Phenylalanine, 20 mM L-Threonine, 2.5 mM L-Tryptophan, 10 mM L-Tyrosine, and 20 mM L-Valine |
| Mini-slab size electrophoresis system | ATTO | AE-6530 | |
| Niacinamide | Sigma-Aldrich | N0636 | |
| Penicilin / Streptomycin | Gibco | 15070063 | |
| PhosSTOP phosphatase inhibitor cocktail | Roche | 4906845001 | |
| Poly-L-lysine hydrobromide | Nacali | 28360-14 | |
| Pyridoxal HCl | Sigma-Aldrich | P6155 | |
| Riboflavin | Sigma-Aldrich | R9504 | |
| Silver Stain 2 Kit wako | Wako | 291-5031 | |
| Thiamine HCl | Sigma-Aldrich | T1270 | |
| Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer Cell | Bio-rad | 1703940JA | |
| Ultra pure water | MilliQ | For production of ultra pure water |
Riferimenti
- Fiala, J. C., Feinberg, M., Popov, V., Harris, K. M. Synaptogenesis via dendritic filopodia in developing hippocampal area CA1. Journal of Neuroscience. 18 (21), 8900-8911 (1998).
- Portera-Cailliau, C., Pan, D. T., Yuste, R. Activity-regulated dynamic behavior of early dendritic protrusions: evidence for different types of dendritic filopodia. Journal of Neuroscience. 23 (18), 7129-7142 (2003).
- Ziv, N. E., Smith, S. J. Evidence for a role of dendritic filopodia in synaptogenesis and spine formation. Neuron. 17 (1), 91-102 (1996).
- Lohmann, C., Bonhoeffer, T. A role for local calcium signaling in rapid synaptic partner selection by dendritic filopodia. Neuron. 59 (2), 253-260 (2008).
- Yoshihara, Y., De Roo, M., Muller, D. Dendritic spine formation and stabilization. Current Opinion in Neurobiology. 19 (2), 146-153 (2009).
- Bayes, A., et al. Comparative study of human and mouse postsynaptic proteomes finds high compositional conservation and abundance differences for key synaptic proteins. PLoS One. 7 (10), e46683 (2012).
- Bayes, A., et al. Characterization of the proteome, diseases and evolution of the human postsynaptic density. Nature Neuroscience. 14 (1), 19-21 (2011).
- Furutani, Y., et al. Interaction between telencephalin and ERM family proteins mediates dendritic filopodia formation. Journal of Neuroscience. 27 (33), 8866-8876 (2007).
- Mao, Y. T., et al. Filopodia Conduct Target Selection in Cortical Neurons Using Differences in Signal Kinetics of a Single Kinase. Neuron. 98 (4), 767-782 (2018).
- Matsuno, H., et al. Telencephalin slows spine maturation. Journal of Neuroscience. 26 (6), 1776-1786 (2006).
- Raemaekers, T., et al. ARF6-mediated endosomal transport of Telencephalin affects dendritic filopodia-to-spine maturation. The EMBO Journal. 31 (15), 3252-3269 (2012).
- Mori, K., Fujita, S. C., Watanabe, Y., Obata, K., Hayaishi, O. Telencephalon-specific antigen identified by monoclonal antibody. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 84 (11), 3921-3925 (1987).
- Yoshihara, Y., Mori, K. Telencephalin: a neuronal area code molecule?. Neuroscience Research. 21 (2), 119-124 (1994).
- Annaert, W. G., et al. Interaction with telencephalin and the amyloid precursor protein predicts a ring structure for presenilins. Neuron. 32 (4), 579-589 (2001).
- Furutani, Y., et al. Vitronectin induces phosphorylation of ezrin/radixin/moesin actin-binding proteins through binding to its novel neuronal receptor telencephalin. Journal of Biological Chemistry. 287 (46), 39041-39049 (2012).
- Nyman-Huttunen, H., Tian, L., Ning, L., Gahmberg, C. G. alpha-Actinin-dependent cytoskeletal anchorage is important for ICAM-5-mediated neuritic outgrowth. Journal of Cell Biology. 119 (Pt 15), 3057-3066 (2006).
- Esselens, C., et al. Presenilin 1 mediates the turnover of telencephalin in hippocampal neurons via an autophagic degradative pathway. Journal of Cell Biology. 166 (7), 1041-1054 (2004).
- Furutani, Y., Yoshihara, Y. Proteomic Analysis of Dendritic Filopodia-Rich Fraction Isolated by Telencephalin and Vitronectin Interaction. Frontiers in Synaptic Neuroscience. 10, 27 (2018).
- Lu, Z., Piechowicz, M., Qiu, S. A Simplified Method for Ultra-Low Density, Long-Term Primary Hippocampal Neuron Culture. Journal of Visualized Experiments. (109), (2016).
- Okabe, S., Miwa, A., Okado, H. Alternative splicing of the C-terminal domain regulates cell surface expression of the NMDA receptor NR1 subunit. The Journal of Neuroscience. 19 (18), 7781-7792 (1999).
- Okabe, S., Vicario-Abejon, C., Segal, M., McKay, R. D. Survival and synaptogenesis of hippocampal neurons without NMDA receptor function in culture. European Journal of Neuroscience. 10 (6), 2192-2198 (1998).
