Här presenterar vi ett protokoll för att extrahera, lösa och identifiera mitokondriella superkomplex som minimerar exponeringen för rengörings medel och Coomassie Blue. Detta protokoll erbjuder en optimal balans mellan upplösning, och bevarande av enzym aktiviteter, samtidigt minimera risken för att förlora labila protein-proteininteraktioner.
Komplex av den oxidativa fosforylering maskiner bildar Supramolekylär protein arrangemang som heter superkomplex (SCs), som tros ge strukturella och funktionella fördelar för mitokondrier. SCs har identifierats i många arter, från jäst till däggdjur, och ett ökande antal studier rapporterar störningar i deras organisation i genetiska och förvärvade mänskliga sjukdomar. Som ett resultat av detta är ett ökande antal laboratorier intresserade av att analysera SCs, vilket kan vara metodologiskt utmanande. I den här artikeln presenteras ett optimerat protokoll som kombinerar fördelarna med metoderna blå-och rensa inbyggda sidor för att lösa och analysera SCs på ett tids effektivt sätt. Med denna hybrid CN/BN-PAGE metod, mitokondriella SCs extraheras med optimala mängder av den milda rengörings medel digitonin utsätts kortfattat för den anjoniska färg ämnet Coomassie Blue (CB) i början av elektrofores, utan exponering för andra rengörings medel. Denna korta exponering för CB gör det möjligt att separera och lösa SCs så effektivt som med traditionella BN-PAGE metoder, samtidigt som man undviker de negativa effekterna av höga CB nivåer på in-gel aktivitet analyser, och labila protein-protein interaktioner inom SCs. Med detta protokoll är det således möjligt att kombinera precisa och snabba mätningar av gel aktivitet med analytiska tekniker som involverar 2D-elektrofores, immuno-detektion och/eller Proteomik för avancerad analys av SCs.
Mitokondrier producera energi genom oxidativ fosforylering, där respiratoriska komplex i-II-III-IV oxidera substrat och överföra elektroner till syre, genererar en gradient som tillåter fosforylering av ADP av ATP syntas (CV). Under de senaste åren har omfattande studier visat att respiratoriska kedje komplex inte enbart införlivas på ett linjärt sätt i det inre mitokondriella membranet, utan också är organiserade i superkomplex (SCs) arrangemang1,2. I mitokondrierna hos däggdjur finns SCs i varierande stökiometrier: CI/CIII2/civ1-4 (som heter respirasome, och som kan NADH: O2 oxidoreduktion in vitro)2, CI/CIII2och CIII2 /Civ1-23,4. Dessutom är respiratoriska komplex fördelas under olika förhållanden mellan deras fri form och SCs arrangemang. Det uppskattas därför att 85% – 100% av CI, 55% – 65% av CIII och 15% – 25% av CIV finns i SCs4. Dessa Supramolekylär strukturer tros minska ROS produktion, stabilisera eller bistå vid montering av enskilda komplex, reglera respiratorisk kedje aktivitet, och förhindra protein aggregation i proteinet rika inre mitokondrie membran5 ,6,7,8. Deras ombyggnad förmåga vid variationer i efter frågan på energi och deras betydelse i patogenesen av sjukdomar unders öks i flera Labs3,7,9,10, 11 för att , 12 av de , 13 det , 14. studier har visat att patologiska förändringar i SCs-sammansättningen finns i en mängd olika sjukdomar, inklusive, men inte begränsat till, genetisk defekt i kardiolipin syntes15, hjärt svikt16, ischemia-reperfusion17, diabetes12, och åldrande18.
Native elektrofores och immunodetection används ofta i SCs studier för att lösa oxphos komplex Kvartära arrangemang2,19,20,21. Native elektrofores kan ytterligare kombineras med specifika i gel verksamhet analyser eller 2D-SDS sida för att möjliggöra exakt molekylär bestämning av de olika SCs församlingar1,19. Förmågan att studera SCs är kritiskt beroende av extraktionsförhållanden, inklusive typ och koncentration av använt disk medel, jonisk styrka och pH, samt på elektrofores förhållanden, som omfattar buffertsammansättning, förekomst av CB, gel storlek och akrylamid i procent2.
Protokoll och SCs band upplösning varierar kraftigt bland papper, göra jämförelser mellan studier svårt och anpassning av metoder utmanande22. Därför föreslår detta dokument ett robust och optimalt protokoll för att extrahera SCs från isolerade mitokondrier av olika källor med den nonjoniska rengörings medel digitonin, och att lösa hög molekyl vikt SCs band. Den optimerade rengörings medels koncentrationen, sammansättningen av extraktionsbufferten och frånvaron av Coomassie Blue i prov preparering minimerar störningen av protein komplex. Detta protokoll (se figur 1 för en översikt) kombinerar CN-Page och bn-Page för optimala SCs-sammansättningar upplösning på stor gel, och är kompatibel med in-gel aktivitet analyser möjliggör bättre visualisering av reaktiva band, tillsammans med användning av immunodetection för en detaljerad analys SCs arrangemang och sammansättning.
Mitokondriella superkomplex är aktivt studeras för att belysa deras fysiologiska roll, och deras betydelse i patogenesen av många mänskliga sjukdomar, oavsett om de förvärvas eller genetiska mitokondriella sjukdomar3,7 , 9 för att , 10 , 11 för att , 12 av de , 13 det , 14. för att uppnå tillförlitliga resultat måste flera aspekter beaktas. Detta protokoll har testats med mus levern mitokondrier, mus Skelett muskel mitokondrier (resultat visas inte), råtta hjärta mitokondrier, och mänskliga fibroblast mitokondrier (resultat visas inte), men kan säkert anpassas till andra källor av isolerade Mitokondrier. Metoden kombinerar på ett optimalt sätt olika aspekter av bn och CN-Page protokoll, som gör det möjligt att minska exponeringen för tvätt-och anjoniska föreningar till ett minimum jämfört med offentliggjorda protokollen20,27,28.
Prov beredning
Prov beredning utgör ett avgörande steg för en lyckad separation av SCs. Buffertsammansättningen bör väljas noggrant för att uppnå korrekt upplösning av proteiner och proteiner, samtidigt som den bevarar så mycket som möjligt av deras funktionella och strukturell integritet. Jonisk styrka och pH i extraktionsbufferten är två viktiga faktorer att beakta. Saltkoncentrationer som är för låga (< 50 mM K-acetat eller NaCl) kommer att resultera i dålig solubilisering av proteiner i närvaro av icke-joniska rengörings medel, medan saltkoncentrationer över 500 mM kommer att främja protein stapling/agg regering, och utfällning av CB och proteiner29. SCs bör därför extraheras med buffertar vid nära fysiologisk jonisk styrka. När det gäller pH, rekommenderas användning av ett nära Fysiologiskt pH.
Rengörings medels typ och rengörings medels/protein förhållande är också avgörande för optimal SC-extraktion. För maximal bevarande av infödda SCs, är digitonin föredras26. Som framgår av detta protokoll och andra publicerade metoder23,30,31,32, detta milda rengörings medel bevarar Supramolekylära sammansättningen av flera SC församlingar, och dimeriskt och oligomeriska strukturen hos Atpsyntas (figur 3 och figur 4). Titrering av proverna av intresse med olika mängder digitonin är avgörande för att identifiera de förhållanden som möjliggör optimal solubilisering, samtidigt som enzym aktivitet och fysiologiska proteininteraktioner. Titrering ska utföras med nyckeltal som varierar mellan 2 och 8 g/g26. Optimala resultat för lever, skelett mus kula tur och kardiella mitokondrier erhålls med 4, 5 och 6 g digitonin/g protein. Det bör noteras att digitonin kan ersättas av Triton X-100, som under optimala förhållanden resulterar i liknande migration och SC sammansättning som de som observerats med digitonin2. Detta rengörings medel bör dock användas med försiktighet, eftersom relativt liten ökning av tvätt medels/protein kvoten (t. ex. från 1 till 1,5 g/g) kan resultera i en fullständig dissociation av SCs-sammansättningar2, vilket kan resultera i experimentella inkonsekvenser. Efter extraktion, är prover traditionellt kompletteras med Coomassie blå för att ge proteiner en laddning när den appliceras på gelen, med undantag för traditionella CN-sidan20,26. För att minimera protein exponeringen till Coomassie blått och potentiell dissociation av labila proteiner, är tar prov inte kompletterat med Coomassie blått i detta protokoll.
Elektrofores
Både CN-PAGE och BN-PAGE har använts för att studera mitokondriella OXPHOS-komplex, var och en av dem har distinkta fördelar och begränsningar. De mildare villkor som används under CN-PAGE (främst avsaknaden av CB, som har en tvätt medel-liknande effekt), möjliggör bättre bevarande av ATP syntas i-gel aktivitet, och begränsar dissociation av labila proteiner i hög molekyl vikt SCs och ATP syntas sammanställningar26. Men avsaknaden av den anjoniska färg ämnet CB i protein extraktet och elektrofores buffertar orsakar proteiner att migrera baserat på deras inneboende laddning och isoelektriska punkt, vilket minskar den elektrofores rörlighet av proteiner inom gel26. Dessutom, i avsaknad av CB, proteiner med otillräcklig negativ laddning tenderar att aggregera, vilket minskar upplösningen av protein komplex i gel20,26. För att kringgå dessa begränsningar har den så kallade högupplösta CN-sidan utvecklats av Wittig och Schragger20. I detta protokoll tillsätts natriumdeoxycholat (DOC) och olika milda icke-joniska rengörings medel (DDM, Triton X100) till katodbufferten för att hålla membran proteiner lösta och införa en negativ laddnings förskjutning på proteiner, vilket resulterar i en avsevärd förbättring resolution20.
Kännetecknande för det nuvarande hybrid CN/BN-protokollet är att en jämförbar lösning kan uppnås utan dessa rengörings medel. Momentan tillsats av CB till katoden buffert i början av elektrofores är tillräckligt för att begränsa protein aggregation och öka rörligheten i gelen (figur 3 och figur 4). Som ett resultat, denna hybrid teknik möjliggör utmärkt upplösning av distinkta SC församlingar och mycket låg eller ingen exponering för rengörings medel. Närvaron av låga mängder CB möjliggör också bättre bevarande av CV-aktivitet, förbättrat bevarande av dimeriskt och oligomeriska CV-sammansättningar (figur 3 och Wittig och schägger 200526), och en reduktion av det blå bakgrunds ljudet som kan kvantifieringen av i gel aktiviteter, särskilt för CII och CIV (figur 2). Avsaknaden av CB i protein extraktet begränsar dessutom störningen av labila proteininteraktioner inom SCs. Till exempel läkar undersökning anslutningen av ATP-synthasen med ANT för att bilda synthasomen 33 eller med Cyclophilin-D för att reglera PTP öppningen 34 ses bättre i frånvaro av CB. Momentan exponering för CB under elektrofores endast kan därför vara användbart för att avslöja nya proteininteraktioner inom SCs. sammantaget gör detta hybrid CN/BN-PAGE-protokoll det möjligt att kombinera exakt och snabbt i mätningar av gel aktivitet med analytiska tekniker som involverar 2D-elektrofores, immuno-detektion och/eller Proteomik för avancerad analys av SCs. Det bör noteras att med det växande intresset för SCs, ett ökande antal studier använder små 10 x 10 cm geler för infödda PAGE. Även om detta tillvägagångs sätt kan vara tillräckligt för att identifiera brutto förändringar i överflöd SC församlingar, den lägre separations kapaciteten hos små geler är sannolikt begränsad till lösa subtila omställningar eller att skära distinkta band för proteomiska analys. Dessutom har flera studier med mindre geler rapporterat att respirasome migrerar i samma storlek som ATPsynthase dimer, vilket gör det svårt att separera dem22. Därför bör användningen av stora geler gynnas.
The authors have nothing to disclose.
Författarna vill tacka Jenna Rossi för tekniskt bistånd, och Dr Mireille Khacho, Dr David Patten och Dr Ujval Anil Kumar för hjälpsam diskussion samtidigt utveckla denna metod. Detta arbete finansierades av kanadensiska institut för hälso forskning (CIHR) och den nationella vetenskaps-och ingenjörs rådet i Kanada (NSERC). AC är en mottagare av doktors priset-Frederick Banting och Charles bästa Kanada Graduate stipendier (CIHR).
3,3'-Diaminobenzidine tetra-hydrochloride hydrate | Sigma | D5637 | |
6-amino caproic acid | sigma | A2504 | |
Acrylamide | Sigma | A3553 | |
Adenosine 5'-triphosphate disodium salt hydrate | sigma | A3377 | |
Anti-ATPB antibody [3D5] – Mitochondrial Marker | Abcam | ab14730 | Lot number GR3174539-12, RRID AB_301438 |
Anti-SDHA antibody [2E3GC12FB2AE2] | Abcam | ab14715 | Lot number GR3235943-1, RRID AB_301433 |
Anti-UQCRC2 antibody [13G12AF12BB11] | Abcam | ab14745 | Lot number GR304308-3, RRID AB_2213640 |
Bis N,N'-Methylene-Bis-Acrylamide | Biorad | 1610201 | |
Brilliant Blue G | Sigma | 27815 | |
COX4 Monoclonal Antibody (1D6E1A8) | Invitrogen | 459600 | Lot number TI2637158, RRID AB_2532240 |
Cytochrome c from equine heart | sigma | C7752 | |
Digitonin | Sigma | D141 | |
Fisherbrand FH100M Multichannel Peristaltic Pumps | Thermo Fisher | 13-310-660 | |
Imidazole | Sigma | I0250 | |
Inner Glass Plates. Pkg of 2, 20 x 20 cm, glass plates for 20 cm PROTEAN II xi and PROTEAN II XL electrophoresis cells, use with outer plate | Biorad | 1651823 | |
Model 485 Gradient Former. 40-175 ml acrylamide gradient former, includes valve stem and tubing kit, for use with Mini-PROTEAN multi-casting chamber systems | Biorad | 1654120 | |
NDUFA9 Monoclonal Antibody (20C11B11B11) | Invitrogen | 459100 | Lot number TD2536591, RRID AB_2532223 |
Nitrotetrazolium Blue chloride | Sigma | N6639 | |
Outer Glass Plates. Pkg of 2, 22.3 x 20 cm, glass plates for 20 cm PROTEAN II xi and PROTEAN II XL electrophoresis cells, use with inner plate | Biorad | 1651824 | |
Phenylmethanesulfonyl floride | Sigma | P7626 | |
Powerpack 1000 | Biorad | Serial Number 286BR 07171 | |
PROTEAN II Sandwich Clamps. Pkg of 2, clamps for running gels, for 20 cm PROTEAN II xi electrophoresis cell, 1 left and 1 right | Biorad | 1651902 | |
PROTEAN II xi Cell. Large format vertical electrophoresis cell, 16 x 20 cm gel size, 4 gel capacity, spacers and combs | Biorad | 1651811 | |
PROTEAN II xi Comb. Pkg of 1, 15-well, 1.5 mm, comb for PROTEAN II xi electrophoresis cell | Biorad | 1651873 | |
PROTEAN II xi Multi-Gel Casting Chamber. Multi-gel casting chamber, 20 x 20 cm gel size, for up to ten 1.5 mm thick gels, includes sealing plate, gasket, separation sheets, acrylic blocks, PROTEAN II XL alignment cards | Biorad | 1652025 | |
PROTEAN II xi Spacers. Pkg of 4, 1.5 mm, spacers for 20 cm PROTEAN II xi electrophoresis cell | Biorad | 1651849 | |
SCIENCEWARE Utility Bags (10 x 12") 4 mil, Bel-Art, Box of 100 | VWR | 11215-388 | |
Thick Blot Paper. Pkg of 25 sheets, 15 x 20 cm, absorbent filter paper, for use with Trans-Blot cassette | Biorad | 1703956 | |
Trans-Blot Cell With Plate Electrodes and Super Cooling Coil. Transfer cell and cooling coil (#170-3912), includes 2 gel holder cassettes, buffer tank, lid with cables, fiber pads, 1 pack blot paper | Biorad | 1703939 |