Her vil vi præsentere en metode til at validere hale vene injektioner i rotter ved at udnytte nær-infrarødt fluorescens billeddiagnostiske data fra farvestoffer indarbejdet i agenter eller biologiske prober. Halen er afbildet før og efter injektionen, den fluorescerende signal er kvantificeret, og en vurdering af injektion kvalitet.
Intravenøs (IV) administration af agenter i halen vene af rotter kan være både svært og inkonsekvent. Optimere hale vene injektioner er en central del af mange eksperimentelle procedurer hvor reagenser skal være indført direkte ind i blodbanen. Uforvarende, kan indsprøjtning være subkutane, muligvis ændre de videnskabelige resultater. Udnytte en nanoemulsion-baserede biologiske sonde med en indbygget nær-infrarødt fluorescerende (NIRF) farvestof, giver denne metode mulighed for imaging en vellykket hale vene injektion in vivo. Med brugen af en NIRF imager tages billeder før og efter indsprøjtning af agenten. En acceptabel IV injektion bestemmes kvalitativt eller kvantitativt derefter baseret på intensiteten af NIRF signal på injektionsstedet.
Indgiftsmåde af agenter i små dyr tjener som et kritisk punkt i mange eksperimenter. Det bestemmer hvor agenten er der skal leveres, og efterfølgende, hvad vil der ske med agenten derefter. Selv om andre ruter kan bruges til agent administration1, er ruten intravenøs levering en foretrukken rute for visse agenser. IV injektion giver agenter sprøjtes direkte ind i blodbanen, omgåelse first-pass væv effekter og behovet for uvedkommende opløste absorption1. Dette giver også mulighed for målretning celler i blodet2,3 og direkte levering til alle væv inden for kredsløbssygdomme. I gnavere, kan flere vener overvejes, herunder jugularis, den saphenous og hale vene.
I denne metode, en NIRF farvestof, der indeholder en biologisk sonde — i dette tilfælde, en nanoemulsion (figur 1A)3,4,5,6— indsprøjtes i den laterale hale vene af rotter. Denne særlige NIRF-holdige nanoemulsion er tidligere blevet brugt til billede og spore neuroinflammation in vivo og ex vivo7,8 i en rotte model9 af neuropatisk smerte2,3,4, 5,10,11. Imaging er udført før og efter indsprøjtning med et prækliniske NIR fluorescens imager (Se Tabel af materialer). Dette tjener som et redskab til at validere kvaliteten af agent administration. Imaging før hale vene injektion tjener som grundlag for at opnå en baseline billede.
I stigende grad i dyreforsøg, er intravenøst administreret nanoemulsions ved at blive udnyttet som biologiske prober og målretning agenter12,13,14,15. Det er en gennemprøvet udfordring til at administrere en agent via hale vene16,17– et stof, en viral vektor eller en anden sonde — og at sikre, at hele indholdet af injektion med succes har indtastet i blodbanen og ikke den omkringliggende væv17. Derfor, en metode til at visualisere og evaluere kvaliteten af en vellykket indsprøjtning er gavnlige.
Typisk, en varmelampe eller varmt vand der bruges til at varme hale, der forårsager dilatation af vene, tillader dens visualisering inden injektionen. Mens dette sikrer lettere indrejse i venen, er der ikke en kvantitativ måde at skelne, om stoffet er trådt i blodbanen i sin helhed18,19,20,21. Dette bliver vanskeligere stadig i stammer af dyr hvor venen kontraster svagt med huden, såsom i sorte mus. Typisk, investigator kan måle en mislykket injektion ved at opleve modstand under injektion, og i nogle tilfælde, visualisere en bule på halen, der angiver en subkutan lækage af agent22,23.
I denne undersøgelse, NIRF billedbehandling af nanoemulsion injiceres i den laterale hale vene af levende rotter er udført på en små-dyrs NIRF imaging system (Se Tabel af materialer). Rotter fodres en særlig renset kost (Se Tabel af materialer) for at reducere uspecifik gut fluorescens. Samtidige billede erhvervelse af hvidt lys og 800 nm Fluorescens er fanget ved hjælp af NIRF imager og tilhørende software. Relative fluorescens intensitet måles på halen på de før injektion og efter indsprøjtning stater. Fluorescens-intensiteten for region af interesse (ROI) på injektionsstedet er registreret og divideret med området af ROI. Kvalitative vurderinger kan laves som injektioner er acceptabel. Eventuelt kan yderligere kvantitative analyser udføres ved at opstille grænseværdier for acceptable injektioner og tildele ROI målinger i grupper, hvorefter der kan beregnes Statistisk signifikans.
Ved at udnytte denne validering strategien efter hale vene injektioner, forbedrer standarden for en forskningsundersøgelse på grund af øget konsistens af agent administration. Denne metode til vurdering af kvaliteten af hale vene injektion kan tilpasses nemt til forskellige injicerbare agenter til at omfatte infrarød fluorescerende sonder leveret kommercielt af flere virksomheder.
Forskningslaboratorier pådrage sig betydelige omkostninger som følge af tager af test agenter. Hale vene injektioner er en vanskelig teknik at mestre at opnå ensartet succesrate, med den mest erfarne af teknikere ofte pådrage tager fejl. Der er ingen pålidelig måde at bekræfte en vellykket injektion. Denne protokol tilbyder en løsning på dette problem ved at give forskere en kvalitativ og kvantitativ metode til at validere en murine hale vene injektion succes. Her, en NIRF-mærket nanoemulsion7,8,25 inkorporerer agent af valg (i dette tilfælde, et lægemiddel) og er afbildet på injektionsstedet i en NIRF lille dyr imager. Der er også mulighed for at udvikle en ikke-nanoemulsion-baserede agent og bruge det samme princip for NIRF billeddannelse ved at indarbejde kommercielt tilgængelige infra-røde farvestoffer. Derudover klar-til-brug imaging agenter med en bred vifte af applikationer, såsom tumor imaging, metabolisk imaging, celle, menneskehandel, og apoptose er også kommercielt tilgængelige. En injektion udføres enten ved hjælp af en steril nål eller, alternativt, en IV kateter; Dette afhænger af præferencen af forskeren. Derudover automatiseret hale vene injektorer26 har været brugt til at hjælpe i denne proces og er kompatible med denne metode. Dog er denne teknologi ikke endnu blevet kommercielt tilgængelige.
Der er vigtige skridt i halen vene injektion metode, der sikrer en højere sats af korrekte agent administration. Først, halen skal rengøres med ethanol til at fjerne snavs eller snavs, giver forskerne bedre visualisere venen. Dilatere venen ved nedsænkning halen i varmt vand er også et meget vigtigt skridt i metoden, da det giver mulighed for et større areal til injektion. Injektion på en mere distale punkt på halen vene giver mulighed for nogle fejl, at flere forsøg er nødvendige. Injektion bør forsøges på en mere proksimale position i halen som hale vene stiger i størrelse som den caudale aspekt af dyrets krop er kontaktet. Derudover kan de kontralaterale hale vene bruges hvis nålen placering ikke i mere end tre til fem websteder på ipsilaterale hale vene.
En vellykket forvaltning af en test agent resulterer i lidt at ingen NIRF signal ved injektion. Hvis ingen modstand er følte under administration af injektion og der er lidt at ingen fluorescens på halen, kan derefter injektion registreres som vellykket. Hvis modstand er følte under injektion, og der er et spor af NIRF signal langs nogle længden af halen, så indsprøjtning er registreret som mislykket og sandsynligvis dels subkutane. Fluorescens billeder er taget før og efter injektion, og kvaliteten af injektion er vurderet af observere kvalitativt eller kvantitativt analysere fluorescens signal på injektionsstedet. Softwaren ledsager NIR fluorescens imager er ofte i stand til at udføre denne analyse.
Metoden kan tilpasses på flere måder. Det gælder til hale vene injektion i både mus og rotter. De fleste små-dyrs NIR fluorescens kameraer vil være i stand til at rumme murine gnavere. Niveauer af anæstesi skal justeres afhængigt af vægten af dyr, i overensstemmelse med forskningslaboratoriums IACUC protokol. En anden eventuel ændring er forberedelsen af en ikke-nanoemulsion-baserede sonde, enten ved at indarbejde en infrarød farvestof i forskerens formulerede agent eller ved at købe en klar-til-brug imaging agent, skræddersyet til en bestemt biologiske program.
Hvis en rotte er relativt store, kan det ofte være svært at placere det i små-dyrs imager. Det anbefales således, at en test billede er taget med dyret i skuffen før injektion, og et synsfelt opgøres hvor halen er synlige. Det er nyttigt at tape hale til skuffe af imager, til at sikre, at den ikke bevæger sig under imaging.
Alternative metoder forsøger at vurdere kvaliteten af hale vene injektioner i små dyr er begrænset til udnyttelse af mærkning reagenser, der ikke forstyrrer samtidige eksperimentelle procedurer og kræver aflivning af dyr postinjection 12,13. Nogle reagenser kan påvirke undersøgelse resultater og den terapeutiske vurdering af dyr, så pleje i eksperimentelle design anbefales.
Denne metode kan i fremtiden være forfinet med fremskridt i små-dyrs imaging-teknologi, samt forbedringer i infrarød fluorescerende sonder. Biologiske sonder med en indbygget infrarød farvestof, designet til en række forskellige applikationer, kan bruges på stadiet agent administration af et forsøgsdesign for at validere kvaliteten af en indsprøjtning, som skitseret i denne metode2,3 ,27,28,29,30,31,32.
The authors have nothing to disclose.
J.A.P. og J.M.J. designet i fællesskab den eksperimentelle tilgang til at vurdere Nanoemulsions i kronisk konstriktion skade rotte model for effekter på neuropatiske smerter. J.M.J. udtænkt og designet samlede makrofag-målrettet drug levering tilgang med nanoemulsions, nanoemulsion sammensætning og processer for fabrikation. J.M.J. produceret nanoemulsion, som blev yderligere fabrikeret af ll under vejledning af J.M.J. Stabiliteten i nanoemulsion blev vurderet af J.M.J., ll og S.P. Animal care, kirurgi, adfærd, hale vene injektioner, og NIRF imaging blev udført i fællesskab af M.S. og A.M.S. under vejledning af J.A.P. Manuskriptet blev skrevet og udarbejdet af M.S., og protokollen blev skrevet af A.M.S.
NIR optiske billeddannelse blev udført på den lille dyr Imaging System på Duquesne Universitet (støttet af Pittsburgh Tissue Engineering initiativ frø Grant). J.M.J. anerkender støtte fra DOD award nummer FA8650-17-2-6836, NIDA award nummer 1R21DA039621-01, NIBIB award nummer R21EB023104-02 og AFMSA Award nummer FA8650-17-2-6836. J.A.P. og J.M.J anerkender støtte fra Pittsburgh Tissue Engineering initiativ frø Grant. J.A.P. anerkender også Hunkele frygtede sygdom Award, Samuel og Emma vintre Foundation, Charles Henry Leach II fond og Commonwealth Universal forskning Enhancement Award. J.A.P. og J.M.J. anerkender støtte fra Duquesne Universitet konstituerende Provst tværfaglig forskning konsortier Grant, som understøtter den kroniske smerter forskningskonsortium.
100% Oxygen air tank | AirGas Heathcare | n/a | For ventilation of animal. |
70% Ethanol | Multiple sources | n/a | |
Alcohol Pads | Henry Schein | 112-6131 | |
Artificial Tears | Henry Schein | 100-2634 | This protects the rats eyes while it is anesthetized. |
Beaker | Multiple sources | n/a | This holds warm water to dilate the tail veins. |
Distilled water | Multiple sources | n/a | |
Exhaust Fans | Hazard Technologies | n/a | For ventilation of lab, if it is not built in. |
Face Mask | Multiple sources | n/a | |
Gas Chamber with tubing and face mask | Multiple sources | n/a | |
Gauze Pads | Henry Schein | 100-2634 | |
Hair Bonnet | Multiple sources | n/a | |
Heating Lamp | Multiple sources | n/a | |
Heating Pad | Multiple sources | n/a | |
Isoflurane | Southmedic Inc. | ND66794-013-25 | |
Padded Bench Cloth | Box Board Products Inc. | 026755100I | |
Pearl Small Animal Imager | Li-COR Biosciences | ||
Pearl Trilogy Small Animal Imaging System | LI-COR Biosciences | n/a | Quote available via manufacturers web site. Other manufacturers such as Perkin Elmer (VisEn Medical FMT) offer preclinical NIR fluoresence imagers. |
Scrubs, lab coat, shoe covers | Multiple sources | n/a | |
Sharps container | Multiple sources | n/a | |
special diet | Research Diets, Inc, New Brunswick, NJ | ||
Sprague-Dawley rats | Hilltop Animals, Springdale, PA | ||
Sterile injection cap | Multiple sources | n/a | |
Sterile needle, 27G | Multiple sources | n/a | |
SURFLO IV Catheter, 24G, yellow | TERUMO | SR+OX2419C1 | This is an alternative to using a sterile needle. It provides additional indication of correct venous insertion. |
Surgical gloves | Multiple sources | n/a | |
Surgical Tape | Multiple sources | n/a |