Her presenterer vi en metode for å validere hale blodåre injeksjoner i rotter ved å benytte nær infrarød fluorescens bildebehandling data fra fargestoffer innlemmet i agenter eller biologiske sonder. Halen er fotografert før og etter injeksjon, fluorescerende signalet er kvantifisert, og en vurdering av injeksjon kvaliteten er laget.
Intravenøs (IV) administrasjon av agenter i halen venen rotter kan være både vanskelig og inkonsekvent. Optimalisere hale blodåre injeksjoner er en viktig del av mange eksperimentelle prosedyrer der reagenser må innføres direkte inn i blodbanen. Ubevisst, kan injeksjon være subkutan, muligens endre vitenskapelige resultatene. Denne metoden bruker en nanoemulsion-baserte biologiske sonde med en innarbeidet nær infrarød fluorescerende (NIRF) fargestoff, og tilbyr evnen Imaging en vellykket hale blodåre injeksjon i vivo. Med bruk av en NIRF imager tas før og etter injeksjon av agenten. En akseptabel IV injeksjon bestemmes kvantitativt eller kvalitativt deretter basert på intensiteten av NIRF signalet på injeksjonsstedet.
Ruten for administrasjon av agenter i små dyr fungerer som et kritisk punkt mange eksperimenter. Bestemmer hvor agent skal leveres og, senere, hva vil skje med agenten etterpå. Selv om andre ruter kan brukes for agent administrasjon1er intravenøs ruten levering en foretrukket rute for visse agenter. IV injeksjon lar agenter til å være direkte injiseres inn i blodet, omgåelsen første-pass vev effekter og behovet for overflødig stoff absorption1. Dette gjør også for målretting celler i blodet2,3 og direkte levering til alle vev i sirkulasjonssystemet. I Red, kan flere vener vurderes, og inkludert jugular, den saphenous og hale venen.
I denne metoden en NIRF fargestoff som inneholder en biologisk sonde – i dette tilfellet, en nanoemulsion (figur 1A)3,4,5,6-injiseres i laterale hale åre rotter. Dette bestemte NIRF inneholder nanoemulsion har vært brukt tidligere bilde og spore neuroinflammation in vivo og ex vivo7,8 i en rotte modell9 nevropatisk smerte2,3,4, 5,10,11. Bildebehandling utføres før og etter injeksjon med en prekliniske NIR fluorescens imager (se Tabell for materiale). Dette fungerer som et verktøy til å validere kvaliteten på agent administrasjonen. Bildebehandling før halen blodåre injeksjon tjener som grunnlag for å oppnå et opprinnelig bilde.
I animal studies, er stadig intravenøst administrert nanoemulsions brukes som biologiske sonder og målretting agenter12,13,14,15. Det er en bevist utfordring å administrere en agent via hale blodåre16,17– være det et legemiddel, en viral vektor eller en annen sonde, og sikre at hele innholdet i injeksjon har angitt blodet og ikke den omkringliggende vev17. En metode for å visualisere og vurdere kvaliteten på en vellykket injeksjon er derfor gunstig.
Vanligvis brukes en heten lampen eller varmt vann å varme halen, som fører til utvidelse av venen, tillater sine visualisering før injeksjon. Mens Dette sikrer enklere inntreden i venen, er det ikke en kvantitativ måte å skjelne om sammensatte er inn blodet i sin helhet18,19,20,21. Dette blir vanskeligere fortsatt i stammer av dyr der fotsporene kontrasterer svakt med hud, som i svart mus. Etterforskeren kan vanligvis måle en mislykket injeksjon av opplever motstand under injeksjon og, i noen tilfeller kan visualisere en kul på halen, som indikerer en subcutaneous lekkasje av agent22,23.
I denne studien NIRF avbildning av nanoemulsion injisert i laterale hale åre live rotter utføres på en liten-dyr NIRF tenkelig system (se Tabell for materiale). Rotter er matet en spesiell renset kosthold (se Tabell for materiale) for å redusere uspesifikke gut fluorescens. Samtidige bildeopptak hvitt lys og 800 nm fluorescens fanges opp ved hjelp av NIRF imager og tilhørende programvare. Relativ fluorescens intensiteten måles på halen pre injeksjon og etter injeksjon States. Fluorescens intensiteten for regionen rundt (ROI) på injeksjonsstedet registreres og delt området av Avkastningen. Kvalitative vurderinger kan gjøres som injeksjoner er akseptabelt. Eventuelt kan videre kvantitativ analyse utføres ved å angi grensene for akseptabel injeksjoner og tilordne avkastning mål i grupper, da statistiske betydning beregnes.
Ved å benytte denne godkjenningsstrategi etter halen blodåre injeksjoner, forbedrer standarden på et forskningsprosjekt på grunn av økt konsistensen av agent administrasjon. Denne metoden for å vurdere kvaliteten på halen blodåre injeksjon kan enkelt tilpasses for ulike injiserbare agenter med infrarød fluorescerende sonder kommersielt fra flere selskaper.
Forskningslaboratorier medførte betydelige kostnader som følge av misadministration testing agenter. Hale blodåre injeksjoner er en vanskelig teknikk å mestre å oppnå konsistent suksessrate, med de mest erfarne av teknologer ofte pådra misadministration feil. Det er ingen pålitelig måte å bekrefte en vellykket injeksjon. Denne protokollen gir en løsning på dette problemet ved å gi forskerne en kvalitativ og kvantitativ metode for å validere suksessen til en murine hale blodåre injeksjon. Her en NIRF-merket nanoemulsion7,8,25 inkorporerer agent av valget (i dette tilfellet et stoff) og er avbildet på injeksjonsstedet i en NIRF liten-dyr imager. Det er også muligheten til å utvikle en ikke-nanoemulsion-baserte agent og bruke samme prinsippet om NIRF bildebehandling ved å innlemme kommersielt tilgjengelige infrarød fargestoffer. I tillegg klar-å-bruke tenkelig agenter med en rekke programmer, for eksempel svulst imaging, metabolske imaging celle menneskehandel, og apoptose er også kommersielt tilgjengelig. Injeksjon utføres enten ved å bruke en steril nål eller alternativt en IV kateter; Dette avhenger av fortrinnsretten forskeren. I tillegg automatisert hale blodåre sprøytebrukere26 har blitt brukt til å bistå i denne prosessen og er kompatible med denne metodikken. Imidlertid blitt denne teknologien ennå ikke kommersielt tilgjengelig.
Det er viktige skritt i halen blodåre injeksjon metoden som sikrer en høyere rate av riktig agent administrasjon. Først burde halen være renset med etanol å fjerne skitt eller rusk, slik at forskere bedre visualisere venen. Utvidelsen fotsporene av submerging halen i varmt vann er også et svært viktig skritt i metoden fordi det gir en større overflate område for injeksjon. Sprøytebruk på et mer distale punkt på halen venen tillater noen feil, at flere forsøk er nødvendig. Injeksjon bør forsøkes på en mer proksimale posisjon i halen som halen venen øker i størrelse da det caudal aspektet av dyrets kroppen er nærmet seg. Kontralateral halen venen kan i tillegg brukes hvis p plassering mislykkes i mer enn tre til fem nettsteder på ipsilateral halen venen.
En vellykket administrasjon av en agent testresultater i liten eller ingen NIRF signal ved injeksjon. Hvis ingen motstand er filt av injeksjon og det er liten eller ingen fluorescens på halen, kan deretter injeksjon registreres så vellykket. Hvis det er en sti av NIRF signalet langs noen lengde på halen, injeksjon registreres som mislykket og trolig delvis subkutan motstand er følte under injeksjon. Fluorescens bilder er tatt før og etter injeksjon, og kvaliteten på injeksjon vurderes ved å observere kvalitativt eller analysere kvantitativt fluorescens signalet på injeksjonsstedet. Programvaren følger NIR fluorescens imager er ofte mulig å utføre denne analysen.
Metoden kan tilpasses på flere måter. Det gjelder hale blodåre injeksjon i både mus og rotter. De fleste liten-dyr NIR fluorescens imagers vil være i stand til accomodating murine gnagere. Nivåer av anestesi må justeres avhengig av vekten av dyret, i samsvar med forskningslaboratoriets IACUC protokollen. En annen mulig endring er utarbeidelsen av en ikke-nanoemulsion-baserte sonde enten ved å innlemme en infrarød fargestoff i forskerens formulert agent eller kjøpe en klar-å-bruke tenkelig agent, skreddersydd for et bestemt biologiske program.
Hvis en rotten er relativt stort, kan det ofte være vanskelig å plassere det i liten-dyr imager. Det anbefales derfor at en testavbildning tas med dyr i skuffen før injisere, og en synsfelt konstatert der halen er synlig. Det er nyttig å tape halen til skuffen til imager, å sikre at det ikke flytte under bildebehandling.
Alternative metoder å vurdere kvaliteten på halen blodåre injeksjoner i små dyr er begrenset til utnyttelsen av merking reagenser som ikke forstyrre samtidige eksperimentelle prosedyrer og krever euthanasia av dyr postinjection 12,13. Noen reagenser kan påvirke studien resultater og terapeutiske vurdering av dyrene involvert, så forsiktighet i eksperimentell design anbefales.
Denne metoden kan i fremtiden, være forbedret med fremskritt i liten-dyr bildeteknologi, samt forbedringer i infrarød fluorescerende sonder. Biologiske sonder med en innarbeidet infrarød fargestoff, designet for en rekke forskjellige programmer, kan brukes på agent administrasjon scenen studie design for å validere kvaliteten på en injeksjon, som beskrevet i denne metoden2,3 ,27,28,29,30,31,32.
The authors have nothing to disclose.
J.A.P. og J.M.J. utviklet i fellesskap den eksperimentelle tilnærmingen for å vurdere Nanoemulsions i kronisk innsnevring skade rotte modell for effekter på nevropatisk smerte. J.M.J. utviklet og designet samlet macrophage målrettede stoffet levering tilnærming med nanoemulsions, nanoemulsion komposisjon, og prosesser for fabrikasjon. J.M.J. produsert av nanoemulsion, som ble ytterligere fabrikkert av ll under veiledning av J.M.J. Stabilitet i nanoemulsion ble vurdert av J.M.J., ll og S.P. dyr omsorg, kirurgi, atferd, hale blodåre injeksjoner og NIRF imaging ble utført i fellesskap av mastergrad og A.M.S under veiledning av J.A.P. Manuskriptet ble skrevet og utarbeidet av M.S., og protokollen ble skrevet av A.M.S.
NIR optisk tenkelig ble utført på små dyr tenkelig systemet på Duquesne University (støttet av Pittsburgh Tissue Engineering initiativ frø tilskuddet). J.M.J. anerkjenner støtte fra DOD prisen nummer FA8650-17-2-6836, NIDA prisen nummer 1R21DA039621-01, NIBIB prisen nummer R21EB023104-02 og AFMSA Award nummer FA8650-17-2-6836. J.A.P. og J.M.J anerkjenner støtte fra Pittsburgh Tissue Engineering initiativ frø stipendet. J.A.P. erkjenner også Hunkele fryktede sykdommen prisen, Samuel og Emma vintre Foundation, Charles Henry Leach II fondet og Commonwealth Universal forskning Enhancement Award. J.A.P. og J.M.J. anerkjenner støtte fra Duquesne University innvielses Provost tverrfaglig forskning konsortier Grant, som støtter kronisk smerte forskning konsortiet.
100% Oxygen air tank | AirGas Heathcare | n/a | For ventilation of animal. |
70% Ethanol | Multiple sources | n/a | |
Alcohol Pads | Henry Schein | 112-6131 | |
Artificial Tears | Henry Schein | 100-2634 | This protects the rats eyes while it is anesthetized. |
Beaker | Multiple sources | n/a | This holds warm water to dilate the tail veins. |
Distilled water | Multiple sources | n/a | |
Exhaust Fans | Hazard Technologies | n/a | For ventilation of lab, if it is not built in. |
Face Mask | Multiple sources | n/a | |
Gas Chamber with tubing and face mask | Multiple sources | n/a | |
Gauze Pads | Henry Schein | 100-2634 | |
Hair Bonnet | Multiple sources | n/a | |
Heating Lamp | Multiple sources | n/a | |
Heating Pad | Multiple sources | n/a | |
Isoflurane | Southmedic Inc. | ND66794-013-25 | |
Padded Bench Cloth | Box Board Products Inc. | 026755100I | |
Pearl Small Animal Imager | Li-COR Biosciences | ||
Pearl Trilogy Small Animal Imaging System | LI-COR Biosciences | n/a | Quote available via manufacturers web site. Other manufacturers such as Perkin Elmer (VisEn Medical FMT) offer preclinical NIR fluoresence imagers. |
Scrubs, lab coat, shoe covers | Multiple sources | n/a | |
Sharps container | Multiple sources | n/a | |
special diet | Research Diets, Inc, New Brunswick, NJ | ||
Sprague-Dawley rats | Hilltop Animals, Springdale, PA | ||
Sterile injection cap | Multiple sources | n/a | |
Sterile needle, 27G | Multiple sources | n/a | |
SURFLO IV Catheter, 24G, yellow | TERUMO | SR+OX2419C1 | This is an alternative to using a sterile needle. It provides additional indication of correct venous insertion. |
Surgical gloves | Multiple sources | n/a | |
Surgical Tape | Multiple sources | n/a |