Génération de peau 3D Organoïde de dérivés du sang de cordon induite par les cellules souches pluripotentes
Summary
Nous vous proposons un protocole qui montre comment différencier des fibroblastes et des kératinocytes de dérivés de cellules souches pluripotentes induites et générer un organoïde peau 3D, à l’aide de ces kératinocytes et des fibroblastes. Ce protocole comporte une étape supplémentaire de la génération d’un modèle de souris humanisées. La technique présentée ici permettra d’améliorer la recherche dermatologique.
Abstract
La peau est l’organe du plus grand et a de nombreuses fonctions. La peau agit comme une barrière physique et protecteur du corps et régule les fonctions corporelles. Biomimetics est l’imitation des modèles, systèmes et éléments de la nature dans le but de résoudre des problèmes complexes de l’homme1. Peau biomimetics est un outil utile pour la recherche sur les maladies in vitro et in vivo en médecine régénérative. Les cellules souches humaines pluripotentes induites (CISP) ont la particularité de la prolifération illimitée et la capacité de différenciation à trois couches de germe. CISP humaine est générés à partir des divers éléments primaires, telles que les cellules sanguines, les kératinocytes, fibroblastes, etc.. Parmi eux, les cellules mononucléaires de sang de cordon (CBMCs) ont émergé comme une source de cellules alternative du point de vue de la médecine régénérative allogénique. CBMCs sont utiles en médecine régénérative parce que human leucocyte antigen (HLA) tapant est essentielle à la cellule système bancaire. Nous fournissons une méthode pour la différenciation des CBMC-CISP en kératinocytes et des fibroblastes et génération d’une peau 3D organoïde. Fibroblastes et des kératinocytes CBMC iPSC-dérivés ont des caractéristiques semblables à une ligne de cellules primaires. Les organoids de peau 3D sont générés en superposant une couche épidermique sur une couche dermique. Par la transplantation de cette organoïde peau 3D, un modèle de souris humanisées est généré. Cette étude montre qu’un organoïde 3D peau humaine d’iPSC dérivé peut être un outil nouveau, alternatif pour la recherche dermatologique in vitro et in vivo.
Introduction
La peau recouvre la surface extérieur du corps et protège les organes internes. La peau a des fonctions diverses, y compris la protection contre les agents pathogènes, d’absorber et de stocker de l’eau, régulation de température du corps et excréter l’organisme des déchets2. Greffes de peau peuvent être classés selon la source de la peau ; greffes à l’aide de la peau d’un autre donneur sont appelés des allogreffes et greffes à l’aide de la peau du patient sont des autogreffes. Bien qu’une autogreffe est privilégiée dans le traitement en raison de ses risques de rejet faible, biopsies de la peau sont difficiles à effectuer sur des patients atteints de lésions graves ou un nombre insuffisant de cellules de la peau. Chez les patients atteints de graves brûlures, trois fois le nombre de cellules de peau est nécessaire pour couvrir de grandes surfaces. La disponibilité limitée des cellules de la peau du corps du patient se traduit dans les situations où les transplantations allogéniques sont nécessaire. Une allogreffe est utilisée temporairement jusqu’à ce que la greffe autologue est possible puisqu’il est généralement rejeté par le système immunitaire de l’hôte après environ 1 semaine3. Pour surmonter le rejet par le système immunitaire du patient, greffes doivent provenir d’une source avec la même identité immunitaire comme le patient4.
CISP humaine est une source émergente de cellules des cellules souches thérapie5. CISP humaine est générés à partir des cellules somatiques, à l’aide de facteurs de reprogrammation comme OCT4, SOX2, Klf4 et c-Myc,6. À l’aide de CISP humaine permet de surmonter les enjeux éthiques et immunologiques des cellules souches embryonnaires (CSE)7,8. CISP humaine ont pluripotence et peut se différencier en trois couches de germe9. La présence de HLA, un facteur critique dans la médecine régénérative, détermine la réponse immunitaire et la possibilité de rejet10. L’utilisation de dérivés de patient CISP résout les problèmes de rejet de la limitation et le système immunitaire cellulaire-source. CBMCs ont également émergé comme une source de cellule de rechange pour la médecine régénérative,11. Obligatoire HLA typage, qui survient au cours d’opérations bancaires CBMC, peut facilement être utilisé pour la recherche et de la transplantation. En outre, homozygote de type HLA CISP peut largement applicable à divers patients12. Une banque de CBMC-iPSC est un roman et une stratégie efficace pour la thérapie cellulaire et médecine régénératrice allogénique12,13,14. Dans cette étude, nous utiliser CBMC-CISP, se différencient en kératinocytes et des fibroblastes et générer des couches stratifiées de peau 3D. Les résultats de cette étude suggèrent qu’un organoïde CBMC iPSC-dérivé de peau 3D est un nouvel outil de recherche dermatologique in vitro et in vivo.
Protocol
Representative Results
Discussion
CISP humaine ont été suggérés comme une nouvelle alternative pour la médecine régénérative personnalisée17. CISP personnalisé dérivé de patient reflète les caractéristiques du patient qui peuvent être utilisés pour la modélisation de maladies, dépistage de drogue et autogreffe18,19. L’utilisation de dérivés de patient CISP peut aussi surmonter les problèmes relatifs aux éléments primaires, un manque d’un nombre a…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par une subvention du Corée Healthcare Technology R & D Project, ministère de santé, de bien-être et d’affaires de la famille, République de Corée (H16C2177, H18C1178).
Materials
| Adenine | Sigma | A2786 | Component of differentiation medium for fibroblast |
| AggreWell Medium (EB formation medium) | STEMCELL | 05893 | EB formation |
| Anti-Fibronectin antibody | abcam | ab23750 | Fibroblast marker |
| Anti-KRT14 antibody | abcam | ab7800 | Keratinocyte marker |
| Anti-Loricrin antibody | abcam | ab85679 | Stratum corneum marker |
| Anti-p63 antibody | abcam | ab124762 | Keratinocyte marker |
| Anti-Vimentin antibody | Santa cruz | sc-7558 | Fibroblast marker |
| BAND AID FLEXIBLE FABRIC | Johnson & Johnson | – | Bandage |
| Basement membrane matrix (Matrigel) | BD | 354277 | Component of differentiation medium for fibroblast |
| BLACK SILK suture | AILEEE | SK617 | Skin graft |
| CaCl2 | Sigma | C5670 | Component of epithelial medium for 3D skin organoid |
| Collagen type I | BD | 354236 | 3D skin organoid |
| Collagen type IV | Santa-cruz | sc-29010 | Component of differentiation medium for keratinocyte |
| Defined keratinocyte-Serum Free Medium | Gibco | 10744-019 | Component of differentiation medium for keratinocyte |
| DMEM, high glucose | Gibco | 11995065 | Component of differentiation medium |
| DMEM/F12 Medium | Gibco | 11330-032 | Component of differentiation medium |
| Essential 8 medium | Gibco | A1517001 | iPSC medium |
| FBS, Qualified | Corning | 35-015-CV | Component of differentiation medium for fibroblast and keratinocyte |
| Glutamax Supplement | Gibco | 35050061 | Component of differentiation medium for fibroblast |
| Insulin | Invtrogen | 12585-014 | Component of differentiation medium for fibroblast and keratinocyte |
| Iris standard curved scissor | Professional | PC-02.10 | Surgical instrument |
| Keratinocyte Serum Free Medium | Gibco | 17005-042 | Component of differentiation medium for keratinocyte |
| L-ascorbic acid 2-phosphata sesquimagnesium salt hydrate | Sigma | A8960 | Component of differentiation medium for keratinocyte |
| MEM Non-Essential Amino Acid | Gibco | 1140050 | Component of differentiation medium for fibroblast |
| Meriam Forceps Thumb 16 cm | HIROSE | HC 2265-1 | Surgical instrument |
| NOD.CB17-Prkdc SCID/J | The Jackson Laboratory | 001303 | Mice strain for skin graft |
| Petri dish 90 mm | Hyundai Micro | H10090 | Plastic ware |
| Recombinant Human BMP-4 | R&D | 314-BP | Component of differentiation medium for keratinocyte |
| Recombinant human EGF protein | R&D | 236-EG | Component of differentiation medium for keratinocyte |
| Retinoic acid | Sigma | R2625 | Component of differentiation medium for keratinocyte |
| T/C Petridish 100 mm, 240/bx | TPP | 93100 | Plastic ware |
| Transferrin | Sigma | T3705 | Component of epithelial medium for 3D skin organoid |
| Transwell-COL collagen-coated membrane inserts | Corning | CLS3492 | Plastic ware for 3D skin organoid |
| Vitronectin | Life technologies | A14700 | iPSC culture |
| Y-27632 Dihydrochloride | peprotech | 1293823 | iPSC culture |
Riferimenti
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