गर्भनाल रक्त से 3 डी त्वचा Organoid का उत्पादन-व्युत्पन्न प्रेरित Pluripotent स्टेम सेल
Summary
हम एक प्रोटोकॉल है कि पता चलता है कि कैसे प्रेरित pluripotent स्टेम सेल के अंतर को keratinocytes और fibroblasts और एक 3 डी त्वचा organoid उत्पंन, इन keratinocytes और फाइब्रोब्लास्ट का उपयोग करने का प्रस्ताव है । इस प्रोटोकॉल एक humanized चूहों मॉडल पैदा करने का एक अतिरिक्त कदम शामिल हैं । तकनीक यहां प्रस्तुत dermatologic अनुसंधान में सुधार होगा ।
Abstract
त्वचा शरीर के सबसे बड़े अंग है और कई कार्य किया है । त्वचा शारीरिक अवरोध और शरीर के रक्षक के रूप में कार्य करती है तथा शारीरिक क्रियाओं को नियंत्रित रखती है । जटिल मानव समस्याओं को हल करने के उद्देश्य से प्रकृति के मॉडलों, प्रणालियों और तत्वों की नकल बायोमिमेटिक्स है । त्वचा बायोमिमेटिक्स में इन विट्रो रोग अनुसंधान के लिए और vivo पुनर्योजी चिकित्सा में एक उपयोगी उपकरण है । मानव प्रेरित pluripotent स्टेम सेल (iPSCs) असीमित प्रसार और तीन रोगाणु परतों के लिए भेदभाव की क्षमता की विशेषता है । मानव iPSCs विभिन्न प्राथमिक कोशिकाओं से उत्पन्न होते हैं, जैसे रक्त कोशिकाओं, keratinocytes, फाइब्रोब्लास्ट, और अधिक. उनमें से, गर्भनाल रक्त mononuclear कोशिकाओं (CBMCs) allogeneic पुनर्योजी चिकित्सा के नजरिए से एक वैकल्पिक कोशिका स्रोत के रूप में उभरा है । Cbmcs पुनर्योजी चिकित्सा में उपयोगी है क्योंकि मानव ल्युकोसैट प्रतिजन (एचएलए) टाइपिंग सेल बैंकिंग प्रणाली के लिए आवश्यक है । हम केराटिनोसाइट्स और फाइब्रोब्लास्ट में सीबीएमसी-आईपीएससी के विभेदन के लिए और 3 डी त्वचा आर्गेनॉइड के उत्पादन के लिए एक विधि प्रदान करते हैं । CBMC-iPSC-व्युत्पंन keratinocytes और फाइब्रोब्लास्ट एक प्राथमिक कोशिका रेखा के समान लक्षण है । 3d त्वचा ऑर्गेनॉइड एक त्वचीय परत पर एक एपिडर्मल परत overlaying द्वारा उत्पंन कर रहे हैं । इस 3D त्वचा organoid प्रत्यारोपण द्वारा, एक humanized चूहों मॉडल उत्पंन होता है । इस अध्ययन से पता चलता है कि एक 3 डी मानव ipsc-व्युत्पंन त्वचा अंगाभ एक उपंयास, विट्रो में dermatologic अनुसंधान के लिए वैकल्पिक उपकरण और vivo में हो सकता है ।
Introduction
त्वचा शरीर की सबसे बाहरी सतह को कवर और आंतरिक अंगों की रक्षा करता है । त्वचा रोगजनकों के खिलाफ की रक्षा करने, अवशोषित और जल भंडारण, शरीर के तापमान को विनियमित करने, और शरीर अपशिष्ट2उत्सर्जन सहित विभिंन कार्य किया है । त्वचा grafts त्वचा स्रोत के आधार पर वर्गीकृत किया जा सकता है; एक और दाता से त्वचा का उपयोग कर grafts allografts कहा जाता है, और grafts रोगी की अपनी त्वचा का उपयोग कर रहे हैं autografts । हालांकि एक autograft पसंदीदा अपने कम अस्वीकृति जोखिम के कारण उपचार है, त्वचा बायोप्सी गंभीर घावों या त्वचा कोशिकाओं की एक अपर्याप्त संख्या के साथ रोगियों पर प्रदर्शन करने के लिए मुश्किल हैं । गंभीर रूप से जलने के साथ रोगियों में, तीन बार त्वचा कोशिकाओं की संख्या के लिए बड़े क्षेत्रों को कवर करने के लिए आवश्यक हैं । एक मरीज के शरीर से त्वचा कोशिकाओं की सीमित उपलब्धता के परिणामस्वरूप ऐसी स्थितियां उत्पन्न होती हैं, जहां एलोजन प्रत्यारोपण आवश्यक होता है । जब तक यह आम तौर पर लगभग 13सप्ताह के बाद मेजबान की प्रतिरक्षा प्रणाली द्वारा अस्वीकार कर दिया है ऑटोलॉगस प्रत्यारोपण किया जा सकता है एक allograft अस्थाई रूप से प्रयोग किया जाता है । रोगी की प्रतिरक्षा प्रणाली द्वारा अस्वीकृति पर काबू पाने के लिए, grafts रोगी4के रूप में एक ही प्रतिरक्षा पहचान के साथ एक स्रोत से आना चाहिए ।
मानव iPSCs स्टेम सेल थेरेपी के लिए कोशिकाओं का एक उभरता स्रोत है5। मानव iPSCs दैहिक कोशिकाओं से उत्पन्न कर रहे हैं, OCT4, SOX2, Klf4, और सी-Myc6जैसे कारकों reprogramming का उपयोग कर. मानव ipscs का उपयोग करके भ्रूण स्टेम कोशिकाओं (escs)7,8के नैतिक और प्रतिरक्षा मुद्दों पर काबू । मानव iPSCs की pluripotency है और तीन रोगाणु परतों में अंतर कर सकते हैं9. एचएलए, पुनर्योजी चिकित्सा में एक महत्वपूर्ण कारक की उपस्थिति, प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया और10अस्वीकृति की संभावना निर्धारित करता है । रोगी से प्राप्त iPSCs का उपयोग सेल की समस्याओं का समाधान-स्रोत सीमा और प्रतिरक्षा प्रणाली अस्वीकृति । CBMCs भी पुनर्योजी चिकित्सा11के लिए एक वैकल्पिक सेल स्रोत के रूप में उभरा है । अनिवार्य एचएलए टाइपिंग, जो CBMC बैंकिंग के दौरान होता है, आसानी से अनुसंधान और प्रत्यारोपण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । इसके अलावा, समयुग्मजी हला-प्रकार ipscs व्यापक रूप से विभिंन रोगियों के लिए लागू कर सकते है12। एक सीबीएमसी-ipsc बैंक सेल थेरेपी और एलोजेनिक पुनर्योजी चिकित्सा के लिए एक उपंयास और कुशल रणनीति12,13,14है । इस अध्ययन में, हम CBMC-iPSCs का उपयोग करें, keratinocytes और fibroblasts में विभेदित, और स्तरित 3 डी त्वचा परतों उत्पन्न. इस अध्ययन के परिणामों से पता चलता है कि सीबीएमसी-ipsc-व्युत्पन्न 3d त्वचा अंगाभ में इन विट्रो के लिए एक उपंयास उपकरण है और vivo में dermatologic अनुसंधान ।
Protocol
Representative Results
Discussion
मानव iPSCs व्यक्तिगत पुनर्योजी चिकित्सा के लिए एक नया विकल्प के रूप में सुझाव दिया गया है17। रोगी से व्युत्पंन व्यक्तिगत ipscs रोगी विशेषताओं है कि रोग मॉडलिंग, दवा स्क्रीनिंग, और ऑटोलॉगस प्रत्यारोप…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
यह काम कोरिया हेल्थकेयर प्रौद्योगिकी आर & डी परियोजना, स्वास्थ्य, कल्याण और परिवार मामलों के मंत्रालय, कोरिया गणराज्य (H16C2177, H18C1178) से एक अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था ।
Materials
| Adenine | Sigma | A2786 | Component of differentiation medium for fibroblast |
| AggreWell Medium (EB formation medium) | STEMCELL | 05893 | EB formation |
| Anti-Fibronectin antibody | abcam | ab23750 | Fibroblast marker |
| Anti-KRT14 antibody | abcam | ab7800 | Keratinocyte marker |
| Anti-Loricrin antibody | abcam | ab85679 | Stratum corneum marker |
| Anti-p63 antibody | abcam | ab124762 | Keratinocyte marker |
| Anti-Vimentin antibody | Santa cruz | sc-7558 | Fibroblast marker |
| BAND AID FLEXIBLE FABRIC | Johnson & Johnson | – | Bandage |
| Basement membrane matrix (Matrigel) | BD | 354277 | Component of differentiation medium for fibroblast |
| BLACK SILK suture | AILEEE | SK617 | Skin graft |
| CaCl2 | Sigma | C5670 | Component of epithelial medium for 3D skin organoid |
| Collagen type I | BD | 354236 | 3D skin organoid |
| Collagen type IV | Santa-cruz | sc-29010 | Component of differentiation medium for keratinocyte |
| Defined keratinocyte-Serum Free Medium | Gibco | 10744-019 | Component of differentiation medium for keratinocyte |
| DMEM, high glucose | Gibco | 11995065 | Component of differentiation medium |
| DMEM/F12 Medium | Gibco | 11330-032 | Component of differentiation medium |
| Essential 8 medium | Gibco | A1517001 | iPSC medium |
| FBS, Qualified | Corning | 35-015-CV | Component of differentiation medium for fibroblast and keratinocyte |
| Glutamax Supplement | Gibco | 35050061 | Component of differentiation medium for fibroblast |
| Insulin | Invtrogen | 12585-014 | Component of differentiation medium for fibroblast and keratinocyte |
| Iris standard curved scissor | Professional | PC-02.10 | Surgical instrument |
| Keratinocyte Serum Free Medium | Gibco | 17005-042 | Component of differentiation medium for keratinocyte |
| L-ascorbic acid 2-phosphata sesquimagnesium salt hydrate | Sigma | A8960 | Component of differentiation medium for keratinocyte |
| MEM Non-Essential Amino Acid | Gibco | 1140050 | Component of differentiation medium for fibroblast |
| Meriam Forceps Thumb 16 cm | HIROSE | HC 2265-1 | Surgical instrument |
| NOD.CB17-Prkdc SCID/J | The Jackson Laboratory | 001303 | Mice strain for skin graft |
| Petri dish 90 mm | Hyundai Micro | H10090 | Plastic ware |
| Recombinant Human BMP-4 | R&D | 314-BP | Component of differentiation medium for keratinocyte |
| Recombinant human EGF protein | R&D | 236-EG | Component of differentiation medium for keratinocyte |
| Retinoic acid | Sigma | R2625 | Component of differentiation medium for keratinocyte |
| T/C Petridish 100 mm, 240/bx | TPP | 93100 | Plastic ware |
| Transferrin | Sigma | T3705 | Component of epithelial medium for 3D skin organoid |
| Transwell-COL collagen-coated membrane inserts | Corning | CLS3492 | Plastic ware for 3D skin organoid |
| Vitronectin | Life technologies | A14700 | iPSC culture |
| Y-27632 Dihydrochloride | peprotech | 1293823 | iPSC culture |
Riferimenti
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