臍帯血由来から 3 D 肌 Organoid の生成誘導多能性幹細胞
1CiSTEM Laboratory, Catholic Induced Pluripotent Stem Cell (iPSC) Research Center, College of Medicine,The Catholic University of Korea, 2Department of Biomedicine & Health Science, Seoul St. Mary’s Hospital, College of Medicine,The Catholic University of Korea, 3Division of Rheumatology, Department of Internal Medicine, Seoul St. Mary’s Hospital, College of Medicine,The Catholic University of Korea
Summary
これらのケラチノ サイトと線維芽細胞を用いた誘導多能性幹細胞由来ケラチノ サイトと線維芽細胞を区別し、3 D 肌 organoid を生成する方法を示すプロトコルを提案します。このプロトコルには、ヒト化マウス モデルを生成する追加の手順が含まれています。ここで紹介しているテクニックは、皮膚の研究が改善されます。
Abstract
皮膚は身体の最大の臓器で、多くの機能。皮膚は、物理的な障壁と体のプロテクターとして機能し、身体機能を調節します。バイオ ・ ミメティクス モデル、システム、および複雑な人間の問題1の解決の為、自然の要素の模倣であります。皮膚バイオミメティックスは体外病研究と生体内再生医療の役に立つツールです。ひと誘導多能性幹細胞 (Ips) 無制限の増殖特性と 3 つの胚葉分化の能力があります。人間の Ips は、様々 な細胞、血液細胞、ケラチノ サイト、線維芽細胞などから生成されます。その中で、臍帯血単核細胞 (CBMCs) は、同種の再生医学の視点から代替セル源として浮上しています。ひと白血球抗原 (HLA) の入力が銀行システムのセルに不可欠であるために、CBMCs、再生医療に役立ちます。我々 は CBMC Ips のケラチノ サイトと線維芽細胞への分化と 3 D 肌 organoid の生成のためのメソッドを提供します。CBMC iPSC 由来ケラチノ サイトと線維芽細胞一次電池ラインと同様の特性があります。3 D 肌 organoids が真皮層に表皮層を重ねることによって生成されます。この 3 D 肌 organoid を移植、ヒト化マウス モデルが生成されます。本研究では、3 D iPSC 由来皮膚における in vitro および in vivo 皮膚研究小説、代替用具であるかもしれないことを示しています。
Introduction
皮膚は身体の外側の表面をカバーし、内臓を保護します。皮膚が病原体からの保護、吸収、保存水など、さまざまな機能、体温を調節し、体を排泄を無駄に2。皮膚移植は皮膚のソースに応じて分類できます。別のドナーからのスキンを使用して移植は移植と呼ばれているし、患者自身の皮膚を使用して移植は自家。自家の低拒絶反応の危険があるため最寄りの治療ですが、皮膚生検は重篤な病変を有する患者または皮膚細胞の数が不足で実行が困難です。重症熱傷患者、皮膚細胞数の 3 倍、大きい区域をカバーするために必要です。Allogenous 移植が必要な状況では患者の体から皮膚細胞の限られた供給の結果します。同種移植片は、までは通常、約 1 週3の後の宿主の免疫系による拒絶されるので、自家移植を行うことが一時的に使用されます。患者さんの免疫システムによって拒絶を克服するためには、移植が患者4と同じ免疫 id とソースから来なければなりません。
ヒト Ips 細胞の幹細胞療法5新たな源であります。人間の Ips は、OCT4、SOX2、Klf4、C-myc6などリプログラミング因子を用いた体細胞から生成されます。胚性幹細胞 (Esc)7,8の倫理的および免疫学的問題を克服する人間 Ips を使用しています。人間 Ips 多能性と 3 つの胚葉9に分化することができます。HLA、再生医療で重要な要因の存在は、免疫反応と拒絶反応10の可能性を決定します。患者由来の Ips の使用は、ソース セル制限と免疫拒絶の問題を解決します。CBMCs も再生医療11代替セル源として浮上しています。CBMC 銀行中に発生する、入力すると、必須の HLA は、研究と移植に簡単に使用できます。さらに、ホモの HLA 型 Ips は、様々 な患者の12に広く適用できます。CBMC iPSC 銀行は小説と細胞療法と同種の再生医療12,13,14のための効率的な戦略です。本研究では CBMC Ips、ケラチノ サイトと線維芽細胞、分化し、層状 3 D スキン層を生成します。本研究の結果は、in vitro および in vivo 皮膚研究のための新しいツールである CBMC iPSC 由来 3 D 肌 organoid をお勧めします。
Protocol
実験室の動物福祉法、ケアおよび実験動物の使用のためのガイドに従い動物を含むすべての手順を行ったし、機関動物ケアによって提供されるガイドラインと齧歯動物実験のためのポリシーと使用委員会 (IACUC) 韓国カトリック大学医学部。研究プロトコルは、韓国のカトリック教の大学 (CUMC-2018-0191-01) の制度検討委員会によって承認されました。2017 と取得した評価会で韓国食品医薬品局の?…
Representative Results
ほとんどの部分は、表皮と真皮の皮膚を構成します。ケラチノ サイトは、表皮の主要な細胞型と線維芽細胞は、真皮の主要な細胞のタイプ。表皮細胞分化のスキームを図 1に示します。CBMC iPCSc はビトロネクチン コーティング皿 (図 1B) に維持されました。本研究では EB 形成を利用した線維芽細胞とケラチノ サイトに CBMC …
Discussion
人間の Ips は、パーソナライズされた再生医療17のための新しい選択肢として提案されています。患者由来のパーソナライズされた Ips は、疾患モデル作製、薬剤のスクリーニングおよび自家移植18,19に使用することができます患者の特性を反映しています。患者由来の Ips の使用も一次電池、十分な細胞数, と免疫反応<sup class="xref"…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、保健福祉家族部、大韓民国 (H16C2177、H18C1178) 韓国医療技術 R & D プロジェクト、省からの助成金によって支えられました。
Materials
| Adenine | Sigma | A2786 | Component of differentiation medium for fibroblast |
| AggreWell Medium (EB formation medium) | STEMCELL | 05893 | EB formation |
| Anti-Fibronectin antibody | abcam | ab23750 | Fibroblast marker |
| Anti-KRT14 antibody | abcam | ab7800 | Keratinocyte marker |
| Anti-Loricrin antibody | abcam | ab85679 | Stratum corneum marker |
| Anti-p63 antibody | abcam | ab124762 | Keratinocyte marker |
| Anti-Vimentin antibody | Santa cruz | sc-7558 | Fibroblast marker |
| BAND AID FLEXIBLE FABRIC | Johnson & Johnson | – | Bandage |
| Basement membrane matrix (Matrigel) | BD | 354277 | Component of differentiation medium for fibroblast |
| BLACK SILK suture | AILEEE | SK617 | Skin graft |
| CaCl2 | Sigma | C5670 | Component of epithelial medium for 3D skin organoid |
| Collagen type I | BD | 354236 | 3D skin organoid |
| Collagen type IV | Santa-cruz | sc-29010 | Component of differentiation medium for keratinocyte |
| Defined keratinocyte-Serum Free Medium | Gibco | 10744-019 | Component of differentiation medium for keratinocyte |
| DMEM, high glucose | Gibco | 11995065 | Component of differentiation medium |
| DMEM/F12 Medium | Gibco | 11330-032 | Component of differentiation medium |
| Essential 8 medium | Gibco | A1517001 | iPSC medium |
| FBS, Qualified | Corning | 35-015-CV | Component of differentiation medium for fibroblast and keratinocyte |
| Glutamax Supplement | Gibco | 35050061 | Component of differentiation medium for fibroblast |
| Insulin | Invtrogen | 12585-014 | Component of differentiation medium for fibroblast and keratinocyte |
| Iris standard curved scissor | Professional | PC-02.10 | Surgical instrument |
| Keratinocyte Serum Free Medium | Gibco | 17005-042 | Component of differentiation medium for keratinocyte |
| L-ascorbic acid 2-phosphata sesquimagnesium salt hydrate | Sigma | A8960 | Component of differentiation medium for keratinocyte |
| MEM Non-Essential Amino Acid | Gibco | 1140050 | Component of differentiation medium for fibroblast |
| Meriam Forceps Thumb 16 cm | HIROSE | HC 2265-1 | Surgical instrument |
| NOD.CB17-Prkdc SCID/J | The Jackson Laboratory | 001303 | Mice strain for skin graft |
| Petri dish 90 mm | Hyundai Micro | H10090 | Plastic ware |
| Recombinant Human BMP-4 | R&D | 314-BP | Component of differentiation medium for keratinocyte |
| Recombinant human EGF protein | R&D | 236-EG | Component of differentiation medium for keratinocyte |
| Retinoic acid | Sigma | R2625 | Component of differentiation medium for keratinocyte |
| T/C Petridish 100 mm, 240/bx | TPP | 93100 | Plastic ware |
| Transferrin | Sigma | T3705 | Component of epithelial medium for 3D skin organoid |
| Transwell-COL collagen-coated membrane inserts | Corning | CLS3492 | Plastic ware for 3D skin organoid |
| Vitronectin | Life technologies | A14700 | iPSC culture |
| Y-27632 Dihydrochloride | peprotech | 1293823 | iPSC culture |
Riferimenti
- Vincent, J. F., Bogatyreva, O. A., Bogatyrev, N. R., Bowyer, A., Pahl, A. K. Biomimetics: its practice and theory. Journal of The Royal Society Interface. 3 (9), 471-482 (2006).
- Madison, K. C. Barrier function of the skin: “la raison d’etre” of the epidermis. Journal of Investigative Dermatology. 121 (2), 231-241 (2003).
- Chen, M., Przyborowski, M., Berthiaume, F. Stem cells for skin tissue engineering and wound healing. Critical Reviews in Biomedical Engineering. 37 (4-5), 399-421 (2009).
- Dixit, S., et al. Immunological challenges associated with artificial skin grafts: available solutions and stem cells in future design of synthetic skin. Journal of Biological Engineering. 11, 49 (2017).
- Yamanaka, S. Induced pluripotent stem cells: past, present, and future. Cell Stem Cell. 10 (6), 678-684 (2012).
- Yamanaka, S. Pluripotency and nuclear reprogramming. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 363 (1500), 2079-2087 (2008).
- Scheiner, Z. S., Talib, S., Feigal, E. G. The potential for immunogenicity of autologous induced pluripotent stem cell-derived therapies. Journal of Biological Chemistry. 289 (8), 4571-4577 (2014).
- Zimmermann, A., Preynat-Seauve, O., Tiercy, J. M., Krause, K. H., Villard, J. Haplotype-based banking of human pluripotent stem cells for transplantation: potential and limitations. Stem Cells and Development. 21 (13), 2364-2373 (2012).
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
- Terasaki, P. I. A brief history of HLA. Immunologic Research. 38 (1-3), 139-148 (2007).
- Haase, A., et al. Generation of induced pluripotent stem cells from human cord blood. Cell Stem Cell. 5 (4), 434-441 (2009).
- Rim, Y. A., et al. Recent progress of national banking project on homozygous HLA-typed induced pluripotent stem cells in South Korea. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 12 (3), 1531-1536 (2018).
- Nakatsuji, N., Nakajima, F., Tokunaga, K. HLA-haplotype banking and iPS cells. Nature Biotechnology. 26 (7), 739-740 (2008).
- Pappas, D. J., et al. Proceedings: human leukocyte antigen haplo-homozygous induced pluripotent stem cell haplobank modeled after the california population: evaluating matching in a multiethnic and admixed population. Stem Cells Translational Medicine. 4 (5), 413-418 (2015).
- Embryoid body formation from human pluripotent stem cells in chemically defined E8 media. StemBook Available from: https://www.stembook.org/node/6632 (2008)
- Kim, Y., et al. Establishment of a complex skin structure via layered co-culture of keratinocytes and fibroblasts derived from induced pluripotent stem cells. Stem Cell Research & Therapy. 9 (1), 217 (2018).
- Diecke, S., Jung, S. M., Lee, J., Ju, J. H. Recent technological updates and clinical applications of induced pluripotent stem cells. The Korean Journal of Internal Medicine. 29 (5), 547-557 (2014).
- Shi, Y., Inoue, H., Wu, J. C., Yamanaka, S. Induced pluripotent stem cell technology: a decade of progress. Nature Reviews Drug Discovery. 16 (2), 115-130 (2017).
- Yoshida, Y., Yamanaka, S. Recent stem cell advances: induced pluripotent stem cells for disease modeling and stem cell-based regeneration. Circulation. 122 (1), 80-87 (2010).
- Pham, T. L., Nguyen, T. T., Van Bui, A., Nguyen, M. T., Van Pham, P. Fetal heart extract facilitates the differentiation of human umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cells into heart muscle precursor cells. Cytotechnology. 68 (4), 645-658 (2016).
- Stecklum, M., et al. Cell differentiation mediated by co-culture of human umbilical cord blood stem cells with murine hepatic cells. In Vitro Cellular & Developmental Biology – Animal. 51 (2), 183-191 (2015).
- Nam, Y., Rim, Y. A., Ju, J. H. Chondrogenic Pellet Formation from Cord Blood-derived Induced Pluripotent Stem Cells. Journal of Visualized Experiments. (124), e55988 (2017).
- Rim, Y. A., Nam, Y., Ju, J. H. Application of Cord Blood and Cord Blood-derived Induced Pluripotent Stem Cells for Cartilage Regeneration. Cell Transplantation. , (2018).
- Shevde, N. K., Mael, A. A. Techniques in embryoid body formation from human pluripotent stem cells. Methods in Molecular Biology. 946, 535-546 (2013).
- Shamis, Y., et al. iPSC-derived fibroblasts demonstrate augmented production and assembly of extracellular matrix proteins. In Vitro Cellular & Developmental Biology – Animal. 48 (2), 112-122 (2012).
- Bikle, D. D., Xie, Z., Tu, C. L. Calcium regulation of keratinocyte differentiation. Expert Review of Endocrinology & Metabolism. 7 (4), 461-472 (2012).
- Bernstam, L. I., Vaughan, F. L., Bernstein, I. A. Keratinocytes grown at the air-liquid interface. In Vitro Cellular & Developmental Biology. 22 (12), 695-705 (1986).
- Prunieras, M., Regnier, M., Woodley, D. Methods for cultivation of keratinocytes with an air-liquid interface. Journal of Investigative Dermatology. 81, 28-33 (1983).
- Steven, A. C., Bisher, M. E., Roop, D. R., Steinert, P. M. Biosynthetic pathways of filaggrin and loricrin–two major proteins expressed by terminally differentiated epidermal keratinocytes. Journal of Structural Biology. 104 (1-3), 150-162 (1990).
- Hohl, D., et al. Characterization of human loricrin. Structure and function of a new class of epidermal cell envelope proteins. Journal of Biological Chemistry. 266 (10), 6626-6636 (1991).
- Bern, R., et al. Original and modified technique of tie-over dressing: Method and application in burn patients. Burns. 44 (5), 1357-1360 (2018).
- Joyce, C. W., Joyce, K. M., Kennedy, A. M., Kelly, J. L. The Running Barbed Tie-over Dressing. Plastic and Reconstructive Surgery – Global Open. 2 (4), 137 (2014).
- Wang, C. K., Nelson, C. F., Brinkman, A. M., Miller, A. C., Hoeffler, W. K. Spontaneous cell sorting of fibroblasts and keratinocytes creates an organotypic human skin equivalent. Journal of Investigative Dermatology. 114 (4), 674-680 (2000).
- Yang, R., et al. Generation of folliculogenic human epithelial stem cells from induced pluripotent stem cells. Nature Communications. 5, 3071 (2014).
Citazione di questo articolo
Kim, Y., Ju, J. H. Generation of 3D Skin Organoid from Cord Blood-derived Induced Pluripotent Stem Cells. J. Vis. Exp. (146), e59297, doi:10.3791/59297 (2019).