Generasjon 3D huden Organoid fra ledningen blod-avledet indusert Pluripotent stamceller
Summary
Vi foreslår en protokoll som viser hvordan å skille indusert pluripotent Stamcelle-avledet keratinocytter og fibroblaster og generere en 3D huden organoid, bruke disse keratinocytter og fibroblaster. Denne protokollen inneholder et ekstra trinn for å generere en humanized mus modell. Teknikken presenteres her vil forbedre dermatologic forskning.
Abstract
Huden er kroppens største organ og har mange funksjoner. Huden fungerer som en fysisk barriere og beskytter av kroppen og regulerer kroppsfunksjoner. Biomimetics er imitasjon av modeller, systemer og elementene for å løse komplekse menneskelige problemer1. Huden biomimetics er et nyttig verktøy for i vitro sykdom forskning og i vivo regenerativ medisin. Menneskelige indusert pluripotent stamceller (iPSCs) har karakteristisk for ubegrenset spredning og differensiering evnen til å tre bakterie lag. Menneskelige iPSCs genereres fra ulike primære celler, for eksempel blodceller, keratinocytter, fibroblaster og mer. Blant dem, ledningen blod mononukleære celler (CBMCs) har dukket opp som en alternativ celle fra perspektivet til allogene regenerativ medisin. CBMCs er nyttige i regenerativ medisin fordi menneskelige leukocytter antigen (HLA) skriver er avgjørende for cellen banksystemet. Vi tilbyr en metode for differensiering av CBMC-iPSCs keratinocytter og fibroblaster og generering av en 3D hud organoid. CBMC-iPSC-avledet keratinocytter og fibroblaster har egenskaper som ligner på en primær cellen linje. 3D huden organoids genereres ved overliggende dypeste laget på et dermal lag. Ved transplanting denne 3D huden organoid, genereres en humanized mus modell. Denne studien viser at en 3D iPSC-avledet huden organoid kan være en roman, alternative verktøy for dermatologic forskning i vitro og in vivo.
Introduction
Huden dekker ytterste overflaten av kroppen og beskytter indre organer. Huden har forskjellige funksjoner, inkludert beskyttelse mot patogener, absorberende og lagring vann, regulerer kroppstemperaturen, og skiller ut kroppen avfall2. Huden grafts kan klassifiseres avhenger på huden kilde; graftene med skall fra en annen donor kalles allografts grafts ved hjelp av pasientens egen hud er autografts. Selv om en autograft er foretrukket behandling på grunn av sin lave avvisning risiko, er hud biopsies vanskelig å utføre på pasienter med alvorlig lesjonene eller et lite antall hudceller. Hos pasienter med alvorlige forbrenninger er tre ganger antall hudceller nødvendig for å dekke store områder. Den begrensede tilgjengeligheten av hudceller fra pasientens kropp resulterer i situasjoner der allogenous transplantasjon er nødvendig. En allograft brukes midlertidig til autolog transplantasjon kan utføres siden den er vanligvis avvist av verten immunsystem etter ca 1 uke3. Å seire over avslag av pasientens immunsystem, må graftene komme fra en kilde med samme immun identitet som pasient4.
Menneskelig iPSCs er en nye celler for stilk cellen terapi5. Menneskelige iPSCs genereres fra somatiske celler, med reprogramming faktorer som OCT4, SOX2, Klf4 og c-Myc6. Bruker human iPSCs seirer etiske og immunologiske saker av embryonale stamceller (ESCs)7,8. Menneskelige iPSCs har pluripotency og kan skille ut tre bakterie lag9. Tilstedeværelsen av HLA, en kritisk faktor i regenerativ medisin, bestemmer immunforsvaret og muligheten for avvisning10. Bruk av pasient-avledede iPSCs løser problemene med cellen kildekode begrensning og immunsystemet avvisning. CBMCs har også dukket opp som en alternativ cellen for regenerativ medisin11. Obligatorisk HLA skriver, som oppstår under CBMC bank, kan enkelt brukes for forskning og transplantasjon. Videre, homozygous HLA-type iPSCs kan vidt gjelder ulike pasienter12. En CBMC-iPSC bank er en roman og effektiv strategi for cellen terapi og allogenic regenerativ medisin12,13,14. I denne studien vi bruker CBMC-iPSCs, i keratinocytter og fibroblaster, og generere lagdelt 3D huden lag. Resultater fra denne studien tyder på at en CBMC-iPSC-avledet 3D huden organoid er en roman verktøy for i vitro og in vivo dermatologic forskning.
Protocol
Representative Results
Discussion
Menneskelige iPSCs har blitt foreslått som et nytt alternativ for personlig regenerativ medisin17. Pasient-avledede personlig iPSCs gjenspeiler pasientens egenskaper som kan brukes for sykdom modellering og narkotikarelaterte screening autolog transplantasjon18,19. Bruk av pasient-avledede iPSCs kan også overvinne problemer vedrørende primære celler, mangel på tilstrekkelig celle tall og immunreaksjoner5,<…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av et stipend fra Korea Healthcare teknologi R & D prosjektet, departementet for helse-, sosial- og familiedepartementet, Sør-Korea (H16C2177, H18C1178).
Materials
| Adenine | Sigma | A2786 | Component of differentiation medium for fibroblast |
| AggreWell Medium (EB formation medium) | STEMCELL | 05893 | EB formation |
| Anti-Fibronectin antibody | abcam | ab23750 | Fibroblast marker |
| Anti-KRT14 antibody | abcam | ab7800 | Keratinocyte marker |
| Anti-Loricrin antibody | abcam | ab85679 | Stratum corneum marker |
| Anti-p63 antibody | abcam | ab124762 | Keratinocyte marker |
| Anti-Vimentin antibody | Santa cruz | sc-7558 | Fibroblast marker |
| BAND AID FLEXIBLE FABRIC | Johnson & Johnson | – | Bandage |
| Basement membrane matrix (Matrigel) | BD | 354277 | Component of differentiation medium for fibroblast |
| BLACK SILK suture | AILEEE | SK617 | Skin graft |
| CaCl2 | Sigma | C5670 | Component of epithelial medium for 3D skin organoid |
| Collagen type I | BD | 354236 | 3D skin organoid |
| Collagen type IV | Santa-cruz | sc-29010 | Component of differentiation medium for keratinocyte |
| Defined keratinocyte-Serum Free Medium | Gibco | 10744-019 | Component of differentiation medium for keratinocyte |
| DMEM, high glucose | Gibco | 11995065 | Component of differentiation medium |
| DMEM/F12 Medium | Gibco | 11330-032 | Component of differentiation medium |
| Essential 8 medium | Gibco | A1517001 | iPSC medium |
| FBS, Qualified | Corning | 35-015-CV | Component of differentiation medium for fibroblast and keratinocyte |
| Glutamax Supplement | Gibco | 35050061 | Component of differentiation medium for fibroblast |
| Insulin | Invtrogen | 12585-014 | Component of differentiation medium for fibroblast and keratinocyte |
| Iris standard curved scissor | Professional | PC-02.10 | Surgical instrument |
| Keratinocyte Serum Free Medium | Gibco | 17005-042 | Component of differentiation medium for keratinocyte |
| L-ascorbic acid 2-phosphata sesquimagnesium salt hydrate | Sigma | A8960 | Component of differentiation medium for keratinocyte |
| MEM Non-Essential Amino Acid | Gibco | 1140050 | Component of differentiation medium for fibroblast |
| Meriam Forceps Thumb 16 cm | HIROSE | HC 2265-1 | Surgical instrument |
| NOD.CB17-Prkdc SCID/J | The Jackson Laboratory | 001303 | Mice strain for skin graft |
| Petri dish 90 mm | Hyundai Micro | H10090 | Plastic ware |
| Recombinant Human BMP-4 | R&D | 314-BP | Component of differentiation medium for keratinocyte |
| Recombinant human EGF protein | R&D | 236-EG | Component of differentiation medium for keratinocyte |
| Retinoic acid | Sigma | R2625 | Component of differentiation medium for keratinocyte |
| T/C Petridish 100 mm, 240/bx | TPP | 93100 | Plastic ware |
| Transferrin | Sigma | T3705 | Component of epithelial medium for 3D skin organoid |
| Transwell-COL collagen-coated membrane inserts | Corning | CLS3492 | Plastic ware for 3D skin organoid |
| Vitronectin | Life technologies | A14700 | iPSC culture |
| Y-27632 Dihydrochloride | peprotech | 1293823 | iPSC culture |
Riferimenti
- Vincent, J. F., Bogatyreva, O. A., Bogatyrev, N. R., Bowyer, A., Pahl, A. K. Biomimetics: its practice and theory. Journal of The Royal Society Interface. 3 (9), 471-482 (2006).
- Madison, K. C. Barrier function of the skin: “la raison d’etre” of the epidermis. Journal of Investigative Dermatology. 121 (2), 231-241 (2003).
- Chen, M., Przyborowski, M., Berthiaume, F. Stem cells for skin tissue engineering and wound healing. Critical Reviews in Biomedical Engineering. 37 (4-5), 399-421 (2009).
- Dixit, S., et al. Immunological challenges associated with artificial skin grafts: available solutions and stem cells in future design of synthetic skin. Journal of Biological Engineering. 11, 49 (2017).
- Yamanaka, S. Induced pluripotent stem cells: past, present, and future. Cell Stem Cell. 10 (6), 678-684 (2012).
- Yamanaka, S. Pluripotency and nuclear reprogramming. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 363 (1500), 2079-2087 (2008).
- Scheiner, Z. S., Talib, S., Feigal, E. G. The potential for immunogenicity of autologous induced pluripotent stem cell-derived therapies. Journal of Biological Chemistry. 289 (8), 4571-4577 (2014).
- Zimmermann, A., Preynat-Seauve, O., Tiercy, J. M., Krause, K. H., Villard, J. Haplotype-based banking of human pluripotent stem cells for transplantation: potential and limitations. Stem Cells and Development. 21 (13), 2364-2373 (2012).
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
- Terasaki, P. I. A brief history of HLA. Immunologic Research. 38 (1-3), 139-148 (2007).
- Haase, A., et al. Generation of induced pluripotent stem cells from human cord blood. Cell Stem Cell. 5 (4), 434-441 (2009).
- Rim, Y. A., et al. Recent progress of national banking project on homozygous HLA-typed induced pluripotent stem cells in South Korea. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 12 (3), 1531-1536 (2018).
- Nakatsuji, N., Nakajima, F., Tokunaga, K. HLA-haplotype banking and iPS cells. Nature Biotechnology. 26 (7), 739-740 (2008).
- Pappas, D. J., et al. Proceedings: human leukocyte antigen haplo-homozygous induced pluripotent stem cell haplobank modeled after the california population: evaluating matching in a multiethnic and admixed population. Stem Cells Translational Medicine. 4 (5), 413-418 (2015).
- Embryoid body formation from human pluripotent stem cells in chemically defined E8 media. StemBook Available from: https://www.stembook.org/node/6632 (2008)
- Kim, Y., et al. Establishment of a complex skin structure via layered co-culture of keratinocytes and fibroblasts derived from induced pluripotent stem cells. Stem Cell Research & Therapy. 9 (1), 217 (2018).
- Diecke, S., Jung, S. M., Lee, J., Ju, J. H. Recent technological updates and clinical applications of induced pluripotent stem cells. The Korean Journal of Internal Medicine. 29 (5), 547-557 (2014).
- Shi, Y., Inoue, H., Wu, J. C., Yamanaka, S. Induced pluripotent stem cell technology: a decade of progress. Nature Reviews Drug Discovery. 16 (2), 115-130 (2017).
- Yoshida, Y., Yamanaka, S. Recent stem cell advances: induced pluripotent stem cells for disease modeling and stem cell-based regeneration. Circulation. 122 (1), 80-87 (2010).
- Pham, T. L., Nguyen, T. T., Van Bui, A., Nguyen, M. T., Van Pham, P. Fetal heart extract facilitates the differentiation of human umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cells into heart muscle precursor cells. Cytotechnology. 68 (4), 645-658 (2016).
- Stecklum, M., et al. Cell differentiation mediated by co-culture of human umbilical cord blood stem cells with murine hepatic cells. In Vitro Cellular & Developmental Biology – Animal. 51 (2), 183-191 (2015).
- Nam, Y., Rim, Y. A., Ju, J. H. Chondrogenic Pellet Formation from Cord Blood-derived Induced Pluripotent Stem Cells. Journal of Visualized Experiments. (124), e55988 (2017).
- Rim, Y. A., Nam, Y., Ju, J. H. Application of Cord Blood and Cord Blood-derived Induced Pluripotent Stem Cells for Cartilage Regeneration. Cell Transplantation. , (2018).
- Shevde, N. K., Mael, A. A. Techniques in embryoid body formation from human pluripotent stem cells. Methods in Molecular Biology. 946, 535-546 (2013).
- Shamis, Y., et al. iPSC-derived fibroblasts demonstrate augmented production and assembly of extracellular matrix proteins. In Vitro Cellular & Developmental Biology – Animal. 48 (2), 112-122 (2012).
- Bikle, D. D., Xie, Z., Tu, C. L. Calcium regulation of keratinocyte differentiation. Expert Review of Endocrinology & Metabolism. 7 (4), 461-472 (2012).
- Bernstam, L. I., Vaughan, F. L., Bernstein, I. A. Keratinocytes grown at the air-liquid interface. In Vitro Cellular & Developmental Biology. 22 (12), 695-705 (1986).
- Prunieras, M., Regnier, M., Woodley, D. Methods for cultivation of keratinocytes with an air-liquid interface. Journal of Investigative Dermatology. 81, 28-33 (1983).
- Steven, A. C., Bisher, M. E., Roop, D. R., Steinert, P. M. Biosynthetic pathways of filaggrin and loricrin–two major proteins expressed by terminally differentiated epidermal keratinocytes. Journal of Structural Biology. 104 (1-3), 150-162 (1990).
- Hohl, D., et al. Characterization of human loricrin. Structure and function of a new class of epidermal cell envelope proteins. Journal of Biological Chemistry. 266 (10), 6626-6636 (1991).
- Bern, R., et al. Original and modified technique of tie-over dressing: Method and application in burn patients. Burns. 44 (5), 1357-1360 (2018).
- Joyce, C. W., Joyce, K. M., Kennedy, A. M., Kelly, J. L. The Running Barbed Tie-over Dressing. Plastic and Reconstructive Surgery – Global Open. 2 (4), 137 (2014).
- Wang, C. K., Nelson, C. F., Brinkman, A. M., Miller, A. C., Hoeffler, W. K. Spontaneous cell sorting of fibroblasts and keratinocytes creates an organotypic human skin equivalent. Journal of Investigative Dermatology. 114 (4), 674-680 (2000).
- Yang, R., et al. Generation of folliculogenic human epithelial stem cells from induced pluripotent stem cells. Nature Communications. 5, 3071 (2014).
