Forbigående uttrykk i Red bete en Biopharmaceutical kandidat vaksine for Type-1 Diabetes

Summary

Her presenterer vi en protokoll for å produsere en oral vaksine kandidat mot Type 1 diabetes i en spiselig plante.

Abstract

Anlegget molekylær oppdrett er bruk av planter å produsere molekyler av interesse. I dette perspektivet, kan planter brukes både som bioreaktorer for produksjon og påfølgende rensing av det endelige produktet og den muntlige direktelevering heterologous proteiner ved spiselige plantearter. I dette arbeidet presenterer vi utviklingen av en kandidat oral vaksine mot Type 1 Diabetes (T1D) i spiselig plante-systemer som bruker dekonstruerte plante virus-basert rekombinant DNA-teknologi, leveres med vakuum infiltrasjon. Våre resultater viser at en red bete er en passende vert for forbigående uttrykket av en menneskelig avledede autoantigen knyttet til T1D, anses å være en lovende kandidat som en T1D vaksine. Bladene produserer autoantigen var grundig preget for deres motstand mot mage fordøyelsen, tilstedeværelse av gjenværende bakteriell og sekundære metabolske profilen, gir en oversikt over prosessen produksjon for å benytte planter for muntlig direktelevering en heterologous protein. Vår analyse viste nesten fullstendig nedvurdering frysetørket kandidat oral vaksine etter en simulert mage fordøyelsen, tyder på at det kreves en innkapsling strategi i produksjon av plante-avledet GAD vaksinen.

Introduction

Siden anlegget molekylærbiologi revolusjonen i 1980, kan plante-baserte systemer for produksjon av biopharmaceuticals betraktes som et alternativ til tradisjonelle systemer basert på mikrobiell og pattedyr celler¹. Planter vise flere fordeler sammenlignet med tradisjonelle plattformer, skalerbarhet, kostnadseffektivitet og sikkerhet blir de mest relevante². Rekombinant produktet kan renset fra transformert anlegget vev og deretter administreres, enten parenterally eller muntlig, og dessuten transformert spiselig plante kan brukes direkte for muntlig levering. Muntlig ruten fremmer samtidig slimhinnene og systemisk immunitet, og det eliminerer behovet for nåler og spesialiserte medisinske personell. Videre eliminerer muntlig levering den komplekse nedstrøms behandlingen, som vanligvis står for 80% av totale produksjonskostnadene for en rekombinante proteiner³. Alle disse fordelene kan oversettes til besparelser i produksjon, utstyr og arbeidskraft redusere kostnadene for hver dose, gjør stoffet rimelig for de fleste av den globale befolkningen.

Flere strategier, både for stabil transformasjon og forbigående uttrykk, ble utviklet for produksjon av rekombinante proteinene i planter. Blant dem gir en høy avkastning dekonstruerte plante virus-basert uttrykk systemet (f.eks magnICON) overlegen ytelse fører høy avkastning av rekombinante proteinene over relativt korte tidsskalaer⁴. Mange eksempler på forbigående uttrykk ved hjelp av plante virus-basert uttrykk systemet i Nicotiana benthamiana planter rapporteres, være gullstandarden produksjon verten. Men regnes denne modellen anlegget ikke som en spiselig Art i alkaloider og andre giftige metabolitter som er akkumuleres i bladene.

I dette arbeidet, beskriver vi sammenligningen mellom to spiselig plante systemer, red bete (Beta vulgaris cv Moulin Rouge) og spinat (Spinacea oleracea cv Industria), for uttrykket av to kandidat former for 65 kDa isoformen av Glutaminsyre dekarboksylasehemmer (GAD65), utført av anlegget virus-basert vektorer⁵. GAD65 er en stor autoantigen knyttet til Type 1 Diabetes (T1D) og det er under etterforskning i menneskets kliniske forsøk å forebygge eller utsette T1D ved å fremkalle toleranse⁶. Produksjonen av GAD65 i planter har vært grundig studert i modellen plantearter Nicotiana tabacum og N. benthamiana^4,5,6,7. Her beskriver vi bruk av spiselige planter for produksjon av molekylet i vev som kan være ment for en muntlig direktelevering. Fra et teknisk synspunkt, vi studerte og valgt systemet for anlegget agroinfiltration og spiselig plante plattformen for GAD65 produksjon ved å evaluere ulike parametere: rekombinante proteiner uttrykket nivåer, gjenværende mikrobiell tillegget i anlegget vev ment for muntlig levering, motstanden av GAD65 til mage fordøyelsen, og bioequivalence av transformert planter med vill-type.

Protocol

1. Red bete og spinat dyrking Vokse red bete (B. vulgaris cv Moulin Rouge) og spinat (S. oleracea cv Industria) planter i en vekst kammer, med 150 µE lysintensiteten, 65% relativ fuktighet, 12t lys/mørke syklus ved 23/21 ° C, henholdsvis. Etter frø spiring, gjødsle plantene to ganger i uken med en 1 g/L løsning på en kommersielt tilgjengelig gjødsel (Tabell for materiale). Agroinfiltration bruke fem-uke-gamle spinat og seks-uke-gamle red bete planter. </…

Representative Results

I dette arbeidet presenteres arbeidsflyten for utviklingen av en oral vaksine spiselig plante vev. Fokus for dette arbeidet er uttrykk for et mål protein i en spiselig vert plantearter og karakterisering av potensielle oral vaksine. Det første trinnet involvert evalueringen av hensiktsmessigheten av plante virus-basert uttrykk teknologien å produsere rekombinante proteinene i spiselig plante systemer. For denne internettsiden…

Discussion

I denne studien viste vi foreløpig analyse for design av en kandidat oral vaksine for autoimmune diabetes. Målet protein for dette eksperimentet var en mutated form av den menneskelige 65 kDa glutamat dekarboksylasehemmer, hvilke produksjon og funksjonalitet er lett synlig og målbare¹². Uttrykket i forskjellige spiselig plante vev ble formidlet av vektorer⁵, som megle høy rekombinante proteiner produksjon i et svært kort tidsperspektiv. Valg av beste kandidat anlegget …

Materials

0.2-μm Minisart RC4 membrane filters	Sartorius-Stedim	17764
2–mercaptoethanol	Sigma	M3148	Toxic; 4 % to make loading buffer with glycerol, SDS and Tris-HCl
4-Morpholineethanesulfonic acid (MES)	Sigma	M8250	pH 5.5
96-well plate	Sarstedt	833924
Acetic acid	Sigma	27221	Corrosive
Acetonitrile LC-MS grade	Sigma	34967
Acetosyringone	Sigma	D134406	Toxic – 0.1 M stock in DMSO
Agar Bacteriological Grade	Applichem	A0949	15 g/L to make LB medium (pH 7.5 with NaOH) with Yeast extract, NaCl and Tryptone
Ammonium formate	Sigma	70221
Anti-eGFP antibody	ABCam	ab290
Anti-GAD 65/67 antibody	Sigma	G5163
Anti-LHCB2 antibody	Agrisera	AS01 003
Brilliant Blue R-250	Sigma	B7920
C18 Column	Grace	–	Alltima HP C18 (150 mm x 2.1 mm; 3 μm) Column
C18 Guard Column	Grace	–	Alltima HP C18 (7.5 mm x 2.1 mm; 5 μm) Guard  Column
CalMag Grower	Peter Excel	15-5-15	Fertilizer
Carbenicillin disodium	Duchefa Biochemie	C0109	Toxic
Chemiluminescence imaging system	BioRad	1708370	ChemiDoc Touch Imaging System
Chloroform	Sigma	C2432
Detergent	Sigma	P5927	Polysorbate 20
Fluorescence reader	Perkin-Elmer	1420-011	VICTOR Multilabel Counter
Formic acid LC-MS grade	Sigma	94318
Glycerol	Sigma	G5516	15 % to make loading buffer with Tris-HCl, SDS and 2–mercaptoethanol
GoTaq G2 polymerase	Promega	M7841
HCl	Sigma	H1758	Corrosive
HILIC Column	Grace	–	Ascentis Express HILIC (150 mm x 2.1 mm; particles size 2.7 μm) Column
HILIC Guard Column	Grace	–	Vision HT HILIC (7.5 mm x 2.1 mm; 3 μm) Guard  Column
Horseradish peroxidase (HRP)-conjugate anti-rabbit antibody	Sigma	A6154	Do not freeze/thaw too many times
HPLC Autosampler	Beckman Coulter	–	System Gold 508 Autosampler
HPLC System	Beckman Coulter	–	System Gold 128 Solvent Module HPLC
Isopropanol	Sigma	24137	Flamable
Kanamycin sulfate	Sigma	K4000	Toxic
KCl	Sigma	P9541	2 g/L with NaCl , Na2HPO4 and KH2PO4 to make PBS
KH2PO4	Sigma	P9791	2.4 g/L with NaCl , Na2HPO4 and KCl to make PBS
Loading Buffer
Luminol solution	Ge Healthcare	RPN2232	Prepare the solution using the ECL Prime Western Blotting System commercial kit
Lyophilizator	5Pascal	LIO5P0000DGT
Mass Spectometer	Bruker Daltonics	–	Bruker Esquire 6000; the mass spectrometer was equipped with an ESI source and the analyzer was an ion trap
Methanol	Sigma	32213
MgSO4	Sigma	M7506
Milk-blocking solution	Ristora	–	3 % in PBS
Na2HPO4	Sigma	S7907	Use with NaH2PO4 to make Sodium Phospate buffer
NaCl	Sigma	S3014	80 g/L with KCl, Na2HPO4 and KH2PO4 to make PBS; 10 g/L to make LB medium (pH 7.5 with NaOH) with Yeast extract, Tryptone and Agar Bacteriological Grade
NaH2PO4	Sigma	S8282	Use with Na2HPO4 to make Sodium Phospate buffer; 14.4 g/L to make PBS
NaOH	Sigma	S8045
Nitrocellulase membrane	Ge Healthcare	10600002
Pepsin from porcine gastric mucosa	Sigma	P7000
Peroxidase substrate ECL	GE Healthcare	RPN2235	Light sensitive material
Pump Vacuum Press	VWR	111400000098
Reagent A	Sigma	B9643	Use 50 parts of this reagent with 1 part of reagent B to prepare BCA working solution
Reagent B	Sigma	B9643	Use 1 part of this reagent with 50 parts of reagent A to prepare BCA working solution
Rifampicin	Duchefa Biochemie	R0146	Toxic – 25 mg/mL stock in DMSO
SDS (Sodium dodecyl sulphate)	Sigma	L3771	Flamable, toxic, corrosive-10 % stock; 3 % to make loading buffer with Tris-HCl, Glycerol and 2–mercaptoethanol
Sodium metabisulphite	Sigma	7681-57-4
Sonicator system	Soltec	090.003.0003	Sonica® 2200 MH; frequency 40 khz
Syringe	Terumo	–
Transparent fixed 300-µL insert glass tubes	Thermo Scientific	11573680
Trizma Base	Sigma	T1503	Adjust pH with 1N HCl to make Tris-HCl buffer, use 1,5M Tris-HCl (pH 6.8) to make loading buffer with SDS, Glycerol and 2–mercaptoethanol
Tryptone	Formedium	TRP03	10 g/L to make LB medium (pH 7.5 with NaOH) with Yeast extract, NaCl and Agar Bacteriological Grade
Vacuum concentrator	Heto	3878 F1-3	Speed-vac System
Water LC-MS grade	Sigma	39253
Yeast extract	Sigma	Y1333	5 g/L to make LB medium (pH 7.5 with NaOH) with Tryptone, NaCl and Agar Bacteriological Grade