Her presenterer vi en protokoll for å produsere en oral vaksine kandidat mot Type 1 diabetes i en spiselig plante.
Anlegget molekylær oppdrett er bruk av planter å produsere molekyler av interesse. I dette perspektivet, kan planter brukes både som bioreaktorer for produksjon og påfølgende rensing av det endelige produktet og den muntlige direktelevering heterologous proteiner ved spiselige plantearter. I dette arbeidet presenterer vi utviklingen av en kandidat oral vaksine mot Type 1 Diabetes (T1D) i spiselig plante-systemer som bruker dekonstruerte plante virus-basert rekombinant DNA-teknologi, leveres med vakuum infiltrasjon. Våre resultater viser at en red bete er en passende vert for forbigående uttrykket av en menneskelig avledede autoantigen knyttet til T1D, anses å være en lovende kandidat som en T1D vaksine. Bladene produserer autoantigen var grundig preget for deres motstand mot mage fordøyelsen, tilstedeværelse av gjenværende bakteriell og sekundære metabolske profilen, gir en oversikt over prosessen produksjon for å benytte planter for muntlig direktelevering en heterologous protein. Vår analyse viste nesten fullstendig nedvurdering frysetørket kandidat oral vaksine etter en simulert mage fordøyelsen, tyder på at det kreves en innkapsling strategi i produksjon av plante-avledet GAD vaksinen.
Siden anlegget molekylærbiologi revolusjonen i 1980, kan plante-baserte systemer for produksjon av biopharmaceuticals betraktes som et alternativ til tradisjonelle systemer basert på mikrobiell og pattedyr celler1. Planter vise flere fordeler sammenlignet med tradisjonelle plattformer, skalerbarhet, kostnadseffektivitet og sikkerhet blir de mest relevante2. Rekombinant produktet kan renset fra transformert anlegget vev og deretter administreres, enten parenterally eller muntlig, og dessuten transformert spiselig plante kan brukes direkte for muntlig levering. Muntlig ruten fremmer samtidig slimhinnene og systemisk immunitet, og det eliminerer behovet for nåler og spesialiserte medisinske personell. Videre eliminerer muntlig levering den komplekse nedstrøms behandlingen, som vanligvis står for 80% av totale produksjonskostnadene for en rekombinante proteiner3. Alle disse fordelene kan oversettes til besparelser i produksjon, utstyr og arbeidskraft redusere kostnadene for hver dose, gjør stoffet rimelig for de fleste av den globale befolkningen.
Flere strategier, både for stabil transformasjon og forbigående uttrykk, ble utviklet for produksjon av rekombinante proteinene i planter. Blant dem gir en høy avkastning dekonstruerte plante virus-basert uttrykk systemet (f.eks magnICON) overlegen ytelse fører høy avkastning av rekombinante proteinene over relativt korte tidsskalaer4. Mange eksempler på forbigående uttrykk ved hjelp av plante virus-basert uttrykk systemet i Nicotiana benthamiana planter rapporteres, være gullstandarden produksjon verten. Men regnes denne modellen anlegget ikke som en spiselig Art i alkaloider og andre giftige metabolitter som er akkumuleres i bladene.
I dette arbeidet, beskriver vi sammenligningen mellom to spiselig plante systemer, red bete (Beta vulgaris cv Moulin Rouge) og spinat (Spinacea oleracea cv Industria), for uttrykket av to kandidat former for 65 kDa isoformen av Glutaminsyre dekarboksylasehemmer (GAD65), utført av anlegget virus-basert vektorer5. GAD65 er en stor autoantigen knyttet til Type 1 Diabetes (T1D) og det er under etterforskning i menneskets kliniske forsøk å forebygge eller utsette T1D ved å fremkalle toleranse6. Produksjonen av GAD65 i planter har vært grundig studert i modellen plantearter Nicotiana tabacum og N. benthamiana4,5,6,7. Her beskriver vi bruk av spiselige planter for produksjon av molekylet i vev som kan være ment for en muntlig direktelevering. Fra et teknisk synspunkt, vi studerte og valgt systemet for anlegget agroinfiltration og spiselig plante plattformen for GAD65 produksjon ved å evaluere ulike parametere: rekombinante proteiner uttrykket nivåer, gjenværende mikrobiell tillegget i anlegget vev ment for muntlig levering, motstanden av GAD65 til mage fordøyelsen, og bioequivalence av transformert planter med vill-type.
I denne studien viste vi foreløpig analyse for design av en kandidat oral vaksine for autoimmune diabetes. Målet protein for dette eksperimentet var en mutated form av den menneskelige 65 kDa glutamat dekarboksylasehemmer, hvilke produksjon og funksjonalitet er lett synlig og målbare12. Uttrykket i forskjellige spiselig plante vev ble formidlet av vektorer5, som megle høy rekombinante proteiner produksjon i et svært kort tidsperspektiv. Valg av beste kandidat anlegget …
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av samarbeidsprosjektet “Bruk av anlegg for produksjon av en autoimmun diabetes spiselige vaksine (eDIVA)” (prosjekt-ID: 891854) finansiert av universitetet i Verona i rammen av samtalen 2014.
0.2-μm Minisart RC4 membrane filters | Sartorius-Stedim | 17764 | |
2–mercaptoethanol | Sigma | M3148 | Toxic; 4 % to make loading buffer with glycerol, SDS and Tris-HCl |
4-Morpholineethanesulfonic acid (MES) | Sigma | M8250 | pH 5.5 |
96-well plate | Sarstedt | 833924 | |
Acetic acid | Sigma | 27221 | Corrosive |
Acetonitrile LC-MS grade | Sigma | 34967 | |
Acetosyringone | Sigma | D134406 | Toxic – 0.1 M stock in DMSO |
Agar Bacteriological Grade | Applichem | A0949 | 15 g/L to make LB medium (pH 7.5 with NaOH) with Yeast extract, NaCl and Tryptone |
Ammonium formate | Sigma | 70221 | |
Anti-eGFP antibody | ABCam | ab290 | |
Anti-GAD 65/67 antibody | Sigma | G5163 | |
Anti-LHCB2 antibody | Agrisera | AS01 003 | |
Brilliant Blue R-250 | Sigma | B7920 | |
C18 Column | Grace | – | Alltima HP C18 (150 mm x 2.1 mm; 3 μm) Column |
C18 Guard Column | Grace | – | Alltima HP C18 (7.5 mm x 2.1 mm; 5 μm) Guard Column |
CalMag Grower | Peter Excel | 15-5-15 | Fertilizer |
Carbenicillin disodium | Duchefa Biochemie | C0109 | Toxic |
Chemiluminescence imaging system | BioRad | 1708370 | ChemiDoc Touch Imaging System |
Chloroform | Sigma | C2432 | |
Detergent | Sigma | P5927 | Polysorbate 20 |
Fluorescence reader | Perkin-Elmer | 1420-011 | VICTOR Multilabel Counter |
Formic acid LC-MS grade | Sigma | 94318 | |
Glycerol | Sigma | G5516 | 15 % to make loading buffer with Tris-HCl, SDS and 2–mercaptoethanol |
GoTaq G2 polymerase | Promega | M7841 | |
HCl | Sigma | H1758 | Corrosive |
HILIC Column | Grace | – | Ascentis Express HILIC (150 mm x 2.1 mm; particles size 2.7 μm) Column |
HILIC Guard Column | Grace | – | Vision HT HILIC (7.5 mm x 2.1 mm; 3 μm) Guard Column |
Horseradish peroxidase (HRP)-conjugate anti-rabbit antibody | Sigma | A6154 | Do not freeze/thaw too many times |
HPLC Autosampler | Beckman Coulter | – | System Gold 508 Autosampler |
HPLC System | Beckman Coulter | – | System Gold 128 Solvent Module HPLC |
Isopropanol | Sigma | 24137 | Flamable |
Kanamycin sulfate | Sigma | K4000 | Toxic |
KCl | Sigma | P9541 | 2 g/L with NaCl , Na2HPO4 and KH2PO4 to make PBS |
KH2PO4 | Sigma | P9791 | 2.4 g/L with NaCl , Na2HPO4 and KCl to make PBS |
Loading Buffer | |||
Luminol solution | Ge Healthcare | RPN2232 | Prepare the solution using the ECL Prime Western Blotting System commercial kit |
Lyophilizator | 5Pascal | LIO5P0000DGT | |
Mass Spectometer | Bruker Daltonics | – | Bruker Esquire 6000; the mass spectrometer was equipped with an ESI source and the analyzer was an ion trap |
Methanol | Sigma | 32213 | |
MgSO4 | Sigma | M7506 | |
Milk-blocking solution | Ristora | – | 3 % in PBS |
Na2HPO4 | Sigma | S7907 | Use with NaH2PO4 to make Sodium Phospate buffer |
NaCl | Sigma | S3014 | 80 g/L with KCl, Na2HPO4 and KH2PO4 to make PBS; 10 g/L to make LB medium (pH 7.5 with NaOH) with Yeast extract, Tryptone and Agar Bacteriological Grade |
NaH2PO4 | Sigma | S8282 | Use with Na2HPO4 to make Sodium Phospate buffer; 14.4 g/L to make PBS |
NaOH | Sigma | S8045 | |
Nitrocellulase membrane | Ge Healthcare | 10600002 | |
Pepsin from porcine gastric mucosa | Sigma | P7000 | |
Peroxidase substrate ECL | GE Healthcare | RPN2235 | Light sensitive material |
Pump Vacuum Press | VWR | 111400000098 | |
Reagent A | Sigma | B9643 | Use 50 parts of this reagent with 1 part of reagent B to prepare BCA working solution |
Reagent B | Sigma | B9643 | Use 1 part of this reagent with 50 parts of reagent A to prepare BCA working solution |
Rifampicin | Duchefa Biochemie | R0146 | Toxic – 25 mg/mL stock in DMSO |
SDS (Sodium dodecyl sulphate) | Sigma | L3771 | Flamable, toxic, corrosive-10 % stock; 3 % to make loading buffer with Tris-HCl, Glycerol and 2–mercaptoethanol |
Sodium metabisulphite | Sigma | 7681-57-4 | |
Sonicator system | Soltec | 090.003.0003 | Sonica® 2200 MH; frequency 40 khz |
Syringe | Terumo | – | |
Transparent fixed 300-µL insert glass tubes | Thermo Scientific | 11573680 | |
Trizma Base | Sigma | T1503 | Adjust pH with 1N HCl to make Tris-HCl buffer, use 1,5M Tris-HCl (pH 6.8) to make loading buffer with SDS, Glycerol and 2–mercaptoethanol |
Tryptone | Formedium | TRP03 | 10 g/L to make LB medium (pH 7.5 with NaOH) with Yeast extract, NaCl and Agar Bacteriological Grade |
Vacuum concentrator | Heto | 3878 F1-3 | Speed-vac System |
Water LC-MS grade | Sigma | 39253 | |
Yeast extract | Sigma | Y1333 | 5 g/L to make LB medium (pH 7.5 with NaOH) with Tryptone, NaCl and Agar Bacteriological Grade |