Efter differentiering Replating av mänskliga pluripotenta stamceller-härledda nervceller för hög innehåll screening av Neuritogenes och synapsen mognad
Summary
Detta protokoll beskriver ett detaljerat förfarande för ombildning och odling av mänskliga stamceller härledda nervceller som tidigare var differentierade från neurala progenitorer in vitro för flera veckor. Förfarandet underlättar Imaging-baserade analyser av neuriter, synapser, och sena uttrycker neuronala markörer i ett format som är förenligt med ljusmikroskop och hög innehåll screening.
Abstract
Neuroner åtskilda i tvådimensionell kultur från mänskliga pluripotenta stamceller-härledda neurala stamceller (NPCs) utgör ett kraftfullt modellsystem för att utforska sjukdomsmekanismer och utföra hög innehåll screening (HCS) att förhöra sammansatta identifiera gen Mutations fenotyper. Men med mänskliga celler övergången från NPC till funktionella, mogna neuron kräver flera veckor. Synapser börjar vanligen bildas efter 3 veckors differentiering i enskiktslager kultur, och flera neuron-specifika proteiner, till exempel den senare uttrycker Pan-neuronala markör Neun, eller lagret 5/6 cerebral kortikala neuron markör CTIP2, börja uttrycka cirka 4-5 veckor efter differentiering. Denna långa differentierings tid kan vara oförenlig med optimala odlingsförhållanden som används för små volymer, multi-well HCS-plattformar. Bland de många utmaningar är behovet av väl följs, jämnt distribuerade celler med minimal cell kluster, och kultur förfaranden som främjar långsiktig lönsamhet och funktionell synaps mognad. En metod är att skilja nervceller i en stor volym format, sedan replate dem vid en senare tidpunkt i HCS-kompatibla multi-brunnar. Vissa stora utmaningar när man använder denna replating tillvägagångssätt gäller reproducerbarhet och cellernas lönsamhet, på grund av stressande störningar i dendritiska och axonala nätverk. Här visar vi en detaljerad och tillförlitlig förfarande för enzymatiskt resuutgifterna Human inducerad pluripotenta stamceller (hipsc)-härledda nervceller efter deras differentiering för 4-8 veckor i en stor volym format, överföra dem till 384-väl i mikrotiterbrunnarna och odlade dem i ytterligare 1-3 veckor med utmärkt cellöverlevnad. Detta återskapande av mänskliga nervceller inte bara tillåter studiet av synapsen församling och mognad inom två veckor från att replating, men också möjliggör studier av neurit förnyelse och tillväxt kon egenskaper. Vi ger exempel på skalbara analyser för neuritogenesis och synaptogenes med en 384-well plattform.
Introduction
Human pluripotenta stamceller (hiPSC)-härledda nervceller är alltmer relevanta inom områdena grundforskning, läkemedelsutveckling, och regenerativ medicin. Arbetsflöden och förfaranden för att optimera sin kultur och underhåll, och förbättra effektiviteten av differentiering i specifika neuronala subtyper, utvecklas snabbt1,2. För att förbättra nyttan och kostnadseffektiviteten av mänskliga stamceller-härledda neuroner som modellsystem mottagliga för hög innehållsanalyser i Drug discovery och Target validering, är det lämpligt att minska den odlings tid som krävs för att generera mogna, funktionella nervceller, samtidigt bibehålla maximal robusthet, reproducerbarhet, och fenotyp relevans. Även om 3-dimensionell Organoid kulturer driver genombrott i neuroutveckling forskning3, 2-dimensionella enskiktslager kulturer är särskilt förenliga med automatiserade Imaging-baserade applikationer på grund av deras minimala vävnad tjocklek.
Anpassningen av avbildningsbaserade screeningmetoder till modeller av mänskliga neurologiska och neuroutvecklingsrelaterade sjukdomar står dock inför en stor utmaning. Den långvariga tidsram över vilken människans nervsystem mognar in vivo kräver förlängd tid i kulturen för att rymma naturliga program av genuttryck och uppnå neuronala mognad.
En praktisk konsekvens av den långa neuronala differentierings program är att upprätthållandet av hipsc-härledda enskiktslager kulturer måste upprätthållas i många veckor för att uppnå adekvat synaps mognad. Under denna tid, neurala progenitorer som förblir odifferentierade fortsätta att dela. Dessa kan snabbt överodla kulturen och tillskriva näringsinnehållet som krävs för att upprätthålla livskraftiga postmitotiska neuroner. Kraftigt dividera neurala stamceller (NPCs) kan också konkurrera med nervceller för tillväxt substrat. Detta kan göra sådana kulturer föremål för problem med dålig vidhäftning, ett tillstånd olämpligt för Imaging-baserade analyser. Dessutom, många utredare tycker att ju mindre kulturen volymen, desto större är svårigheten att upprätthålla friska populationer av differentierade neuroner tillräckligt länge för att Observera de sena stadierna av neuronala differentiering. Med andra ord, analyser av synapsen mognad med hög innehåll screening (HCS) metoder kan vara mycket utmanande för människa-härledda nervceller.
För att kringgå några av dessa problem, ett förfarande för resuspenering och återför ande tidigare differentierade hiPSC-härledda nervceller har använts. För det första, det tillåter studiet av neurit utväxt (eller, mer exakt, neurit förnyelse) i en population av fullt engagerade nervceller. För det andra, återplantering av tidigare differentierade neuroner från en stor volym format (som 10 cm plattor eller större), ner till små volym format (som HCS-kompatibla 96-eller 384-väl mikrotiter plattor) möjliggör en signifikant minskning av den totala odlings tiden i det lilla volym tillståndet. Detta underlättar studiet av synapsen församling och mognad under efterföljande veckor in vitro-.
Emellertid, den återplaning av mogna nervceller som redan har etablerat långa neuriter och en komplex anslutning nätverk presenterar flera utmaningar, varav en är den ibland höga och rörliga frekvensen av celldöd. Här beskriver vi ett replating förfarande som resulterar i utmärkt cellöverlevnad och reproducerbarhet. Vanligtvis, neuroner utsätts för proteolytiska enzymer för korta inkubationstider (typiskt ~ 3-10 min) för att lossa celler från underlaget före triturering. Denna korta proteolys tid används vanligtvis för att omlägga och passaging många typer av skiljande celler, inklusive icke-neuronala celler och odifferentierade stamceller4,5,6. Emellertid, för differentierade nervceller som bär långa, sammankopplade neuriter, det är viktigt att inte bara lossa celler från underlaget utan också att störa dendritiska och axonala nätverk för att isolera enskilda celler samtidigt minimera skador. Faktum är att en tjock meshwork av nervceller tenderar oftast att lossa från underlaget som ett enda ark, snarare än som enskilda celler. Om försiktighet inte vidtas för att lossa det tjocka nätet av neuriter, nervceller inte bara bli oåterkalleligt skadas under trituration, men många av dem misslyckas med att passera genom filtret används för att ta bort klumpar, vilket resulterar i dålig cell avkastning. Nedan beskriver vi en enkel modifiering av en allmänt använd proteasinkubations procedur för att motverka dessa svårigheter.
I protokollet som beskrivs nedan, neuroner inkuberas för 40-45 min med en mild proteas, såsom proteolytiska enzymet (t. ex., Accutase). Under de första 5-10 min efter tillsats av enzymet, lyfter neuronala nätverk bort från underlaget som ett ark. Inkubering med proteasen fortsätter för ytterligare 30-40 min innan du fortsätter med mild sönderdelning och filtrering. Denna extra inkubationstid hjälper till att säkerställa att nedbrytning av materialet slappnar av det intercellulära nätverket, vilket säkerställer att efterföljande sönderdelning ger en suspension av enskilda celler. Denna procedur maximerar likformigheten i cell fördelningen vid återplaning och minimerar celldöd. Vi har framgångsrikt tillämpat denna replating metod för att hipsc-härledda neuronala kulturer som genereras av olika differentiering protokoll7,8 och från olika rader av hipscs. Förfarandet är nominellt lämplig för användning med de flesta eller alla rader av stamceller härledda nervceller. Vi har konstaterat att en förlängd inkubationstid för proteas inte är absolut nödvändig för att återplantera kulturer från små format plåtar (t. ex. 35 mm diameter). men, som vi visar här, det ger en betydande fördel när återplaning från stora diameter plattor (t. ex., 10 cm diameter eller större), förmodligen för att neuriter i sådana plåtar kan förlänga mycket långa processer och bildar en tätt sammankopplade array.
Här visar vi denna metod och kortfattat illustrera dess tillämpning i analyser för tidig neuritogenes och för synapsen mognad, vilket innebär klustring av pre-och postsynaptiska proteiner längs dendriter och axoner, följt av deras senare colocalization på synaptiska platser. Exemplen belyser de fördelar som detta protokoll erbjuder för att bevara cellernas lönsamhet och reproducerbarhet. Först, det tillåter utredare att studera tidiga steg i mänskliga neuritogenes. Den experimentella inställningen liknar de vanligaste primära kulturerna av gnagare kortikala eller Hippocampus nervceller, där celler extraheras från sena foster eller tidig postnatal hjärna, dissocierade av sönderdelning efter mild proteasbehandling, och får initiera neuriter eller att återskapa neuriter som avskiljdes i förfarandet9,10. Liknar sådana gnagare primära nervceller, hipsc-härledda nervceller börjar bilda eller regenerera sina neuriter inom några timmar efter att ha återfått, vilket möjliggör avbildning av tillväxt koner och påverkar morfologi i en miljö som är optimal för hög spatiotemporal avbildning med färre omgivande odifferentierade celler. Vi har observerat att påverkar utväxt är mer synkroniserad jämfört med de rörliga förseningar och olika utväxt priser sett när neuroner först börja skilja från en stamfader population. Dessutom, replating möjliggör analyser av nervceller uttrycker neuronala subtyp markörer som typiskt visas senare i neurala utveckling, såsom kortikala lagret 5/6 transkription Factor CTIP2 (kyckling äggalbumin uppströms promotor transkription faktor-interagerande protein 2), eller den pan-neuronala markören NeuN11. En särskilt användbar funktion i den replating tillvägagångssätt är att synaptogenes vinning inom en tidsram kompatibel med HCS.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vi har visat en rättfram förfarande för resuspension och återskapande av mänskliga neuronala kulturer som optimerar lönsamheten, differentiering framgång, och subcellulär avbildning på ett sätt som är förenligt med hög innehåll screening plattformar, och andra analyser som är relevanta för läkemedels upptäckt. Figur 6 illustrerar det övergripande arbetsflödet och exempel på sådana program.
Även här fokuserade vi på hiPSC-härledda nervcell…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete är en del av de nationella kooperativa omprogrammerade cell forskargrupper (NCRCRG) för att studera psykisk sjukdom och stöddes av NIH Grant U19MH1 2015-0644. Det inledande arbetet stöddes också av NIH Grant NS070297. Vi tackar DRS. Carol Marchetto och fred Gage, den Salk Institute, för att tillhandahålla WT 126 linje av neurala stamceller, och DRS. Eugene Yeo och Lawrence Goldstein, UC San Diego för att tillhandahålla CVB WT24 linje av neurala stamceller. Vi tackar Deborah pre i laboratoriet för Dr Anne Bang, Sanford Burnham Prebys Medical Discovery Institute, för användbara diskussioner.
Materials
| Post Replating Media | |||
| L-Ascorbic Acid | Sigma | A4403 | Add 1ml of 200mM stock to 1L of N2B27 media |
| dibutyryl-cAMP | Sigma | D0627 | Add 1 µM |
| Human BDNF | Peprotech | 450-02 | 10 ng/ml final concentration |
| B27 (50X) | Thermofisher Scientific | 17504044 | Add 20 ml to 1L N2B27 media |
| DMEM/F12 with Glutamax | Thermofisher Scientific | 31331093 | Add N2 and distribute in 50 mL conicals; parafilm wrap lids |
| Human GDNF | Peprotech | 450-10 | 10 ng/ml final concentration |
| Glutamax | Thermofisher Scientific | 35050038 | Add 10 ml to 1L N2B27 media; glutamine supplement |
| Mouse Laminin | Sigma | P3655-10mg | Add 100 µl to 50 mL N2B27 |
| MEM Nonessential Amino Acids | Thermofisher Scientific | 11140035 | Add 5ml to 1L N2B27 media |
| N2 (100X) Supplement | Life Technologies | 17502048 | Add 5ml to 500mL media |
| Neurobasal A Media | Thermofisher Scientific | 10888022 | Combine with DMEM/F12 to generate N2B27 media for CVB wt cells; neural basal A media |
| Neurobasal Media | Thermofisher Scientific | 21103049 | for WT126 cells; neural basal media |
| SM1 Supplement | StemCell Technologies | 5711 | Add 1:50 to media |
| sodium bicarbonate | Thermofisher Scientific | 25080-094 | Add 10ml to 1L N2B27 media |
| Plate Preparation | |||
| 10cm Tissue Culture Dishes | Fisher Scientific | 08772-E | Plastic TC-treated dishes |
| 6-well Tissue Culture Dishes | Thomas Scientific | 1194Y80 | NEST plates |
| Mouse Laminin | Life Technologies | 23017-015 | Add 1:400 on plastic |
| Poly-Ornithine | Sigma | P3655-10mg | Add 1:1000 on plastic |
| UltraPure Distilled Water | Life Technologies | 10977-015 | To dilute Poly-L-Ornithine |
| Replating Reagents | |||
| 100mM Cell Strainer | Corning | 431752 | Sterile, individually wrapped |
| 384-well plate, uncoated | PerkinElmer | 6007550 | Coat with PLO and Laminin |
| DPBS | Life Technologies | 14190144 | Dulbecco's phosphate-buffered saline |
| Poly-D-Lysine-Precoated 384-well Plates | PerkinElmer | 6057500 | Rinse before coating with laminin |
| StemPro Accutase | Life Technologies | A1110501 | Apply 1mL/10cm plate for 30-45 minutes; proteolytic enzyme |
| Fixation Materials | |||
| 37% Formaldehyde | Fisher Scientific | F79-1 | Dissolved in PBS |
| Sucrose | Fisher Scientific | S5-12 | 0.8 g per 10 ml of fixative |
| Immunostaining Materials | |||
| Alexa Fluor 488 Goat anti-mouse | Invitrogen | A-11001 | secondary antibody |
| Alexa Fluor 568 Goat anti-chicken | Invitrogen | A-11041 | secondary antibody |
| Alexa Fluor 647 Goat anti-chicken | Invitrogen | A-21449 | secondary antibody |
| Alexa Fluor 561 Goat anti-rat | Invitrogen | A-11077 | secondary antibody |
| DAPI | Biotium | 40043 | visualizes DNA |
| mouse antibody against b3-tubulin (TuJ-1) | Neuromics | MO15013 | early stage neuronal marker |
| rat antibody against CTIP2 | Abcam | ab18465 | layer 5/6 cortical neurons |
| chicken antibody against MAP2 | LifeSpan Biosciences | LS-B290 | early stage neuronal marker |
| chicken antibody against NeuN | Millipore | ABN91 | late stage neuronal marker |
| rabbit antibody against MAP2 | Shelley Halpain | N/A | early stage neuronal marker |
| mouse antibody against PSD-95 | Sigma | P-246 | post-synaptic marker |
| rabbit antibody against Synapsin 1 | Millipore | AB1543 | pre-synaptic marker |
| Bovine serum albumin (BSA) | GE Healthcare Life Sciences | SH30574.02 | 10% in PBS for blocking |
| Titon X-100 | Sigma | 9002931 | Dilute to 0.2% on PBS for permeabilization |
| Viability Markers | |||
| Vivafix 649/660 | Biorad | 135-1118 | cell death marker |
| Calcium Imaging | |||
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| AAV8-syn-jGCAMP7f-WPRE | THE SALK INSTITUTE, GT3 Core Facility | N/A | calcium reporter in a viral delivery system |
| hiPSC-derived NPCs | |||
| WT 126 (Y2610) | Gage lab | N/A | Marchetto et al., 2010 |
| CVB WT24 | Yeo and Goldstein labs | N/A | unpublished |
Riferimenti
- Engel, M., Do-Ha, D., Munoz, S. S., Ooi, L. Common pitfalls of stem cell differentiation: a guide to improving protocols for neurodegenerative disease models and research. Cell and Molecular Life Sciences. 73 (19), 3693-3709 (2016).
- Kim, D. S., Ross, P. J., Zaslavsky, K., Ellis, J. Optimizing neuronal differentiation from induced pluripotent stem cells to model ASD. Frontiers in Cellular Neuroscience. 8, 109 (2014).
- Amin, N. D., Paşca, S. P. Building Models of Brain Disorders with Three-Dimensional Organoids. Neuron. 100 (2), 389-405 (2018).
- Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Passaging Cells. Journal of Visualized Experiments. , (2019).
- Langdon, S. P. . Cancer Cell Culture. , (2010).
- Picot, J. . Human Cell Culture Protocols. 107, (2005).
- Marchetto, M. C., et al. A model for neural development and treatment of Rett syndrome using human induced pluripotent stem cells. Cell. 143 (4), 527-539 (2010).
- Shi, Y., Kirwan, P., Livesey, F. J. Directed differentiation of human pluripotent stem cells to cerebral cortex neurons and neural networks. Nature Protocols. 7 (10), 1836-1846 (2012).
- Banker, G., Goslin, K. Developments in neuronal cell culture. Nature. 336 (6195), 185-186 (1988).
- Calabrese, B., Halpain, S. Essential role for the PKC target MARCKS in maintaining dendritic spine morphology. Neuron. 48 (1), 77-90 (2005).
- Mullen, R. J., Buck, C. R., Smith, A. M. NeuN, a neuronal specific nuclear protein in vertebrates. Development. 116 (1), 201-211 (1992).
- Calabrese, B., Saffin, J. M., Halpain, S. Activity-dependent dendritic spine shrinkage and growth involve downregulation of cofilin via distinct mechanisms. PLOS One. 9 (4), 94787 (2014).
- Carpenter, A. E., et al. CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes. Genome Biology. 7 (10), 100 (2006).
- Gupta, S., et al. Deriving Dorsal Spinal Sensory Interneurons from Human Pluripotent Stem Cells. Stem Cell Reports. 10 (2), 390-405 (2018).
- Ogura, T., Sakaguchi, H., Miyamoto, S., Takahashi, J. Three-dimensional induction of dorsal, intermediate and ventral spinal cord tissues from human pluripotent stem cells. Development. 145, (2018).
- Playne, R., Jones, K., Connor, B. Generation of dopamine neuronal-like cells from induced neural precursors derived from adult human cells by non-viral expression of lineage factors. Journal of Stem Cells and Regenerative Medicine. 14 (1), 34-44 (2018).
- Rao, M. S., et al. Illustrating the potency of current Good Manufacturing Practice-compliant induced pluripotent stem cell lines as a source of multiple cell lineages using standardized protocols. Cytotherapy. 20 (6), 861-872 (2018).
- Suga, H. Differentiation of pluripotent stem cells into hypothalamic and pituitary cells. Neuroendocrinology. 101 (1), 18-24 (2015).
- Endaya, B., et al. Isolating dividing neural and brain tumour cells for gene expression profiling. Journal of Neuroscience Methods. 257, 121-133 (2016).
- Sergent-Tanguy, S., Chagneau, C., Neveu, I., Naveilhan, P. Fluorescent activated cell sorting (FACS): a rapid and reliable method to estimate the number of neurons in a mixed population. Journal of Neuroscience Methods. 129 (1), 73-79 (2003).
- Frega, M., et al. Rapid Neuronal Differentiation of Induced Pluripotent Stem Cells for Measuring Network Activity on Micro-electrode Arrays. Journal of Visualized Experiments. (119), e54900 (2017).
- Grainger, A. I., et al. In vitro Models for Seizure-Liability Testing Using Induced Pluripotent Stem Cells. Frontiers in Neuroscience. 12, 590 (2018).
- Daub, A., Sharma, P., Finkbeiner, S. High-content screening of primary neurons: ready for prime time. Current Opinion in Neurobiology. 19 (5), 537-543 (2009).
