Detta arbete presenterar ett protokoll för upprättande av en cell SUS pension kultur som härrör från te (Camellia sinensis L.) blad som kan användas för att studera metabolismen av externa föreningar som kan tas upp av hela växten, såsom insekticider.
En plattform för att studera insekticid metabolism med hjälp av in vitro-vävnader av teplantan utvecklades. Blad från sterila te plantlets induceras för att bilda lös förhårdnader på murashige och Skoog (MS) basal media med växthormoner 2, 4-diklorfenoxiättiksyra (2, 4-D, 1,0 mg l-1) och kinetin (kt, 0,1 mg l-1). Callus bildades efter 3 eller 4 omgångar av subculturing, varje varar 28 dagar. Lös Valk (ca 3 g) inokulerades sedan till B5 flytande media som innehöll samma växthormoner och odlades i en skakinkubator (120 rpm) i mörker vid 25 ± 1 ° c. Efter 3 − 4 subkulturer, en cell SUS pension som härrör från teblad fastställdes vid en subkultur ratio mellan 1:1 och 1:2 (SUS pension moder vätska: färskt medium). Med hjälp av denna plattform, sex insekticider (5 μg mL-1 varje thiamethoxam, imidakloprid, acetamiprid, imidaklothiz, dimetoat, och omethoate) lades till Tea Leaf-derived cell SUS pension kultur. Metabolismen av insekticider spåras med hjälp av vätskekromatografi och gaskromatografi. För att validera nyttan av te cell SUS pension kultur, metaboliterna av tiamethoxan och dimetoat närvarande i behandlade cell kulturer och intakt växter jämfördes med hjälp av masspektrometri. I behandlade te cell kulturer hittades sju metaboliter av tiamethoxan och två metaboliter av dimetoat, medan de i behandlade intakta växter endast fann två metaboliter av tiamethoxam och en av dimetoat. Användningen av en cell SUS pension förenklat metabolisk analys jämfört med användning av intakt te växter, särskilt för en svår matris som te.
Te är en av de mest konsumerade alkoholfria dryckerna i världen1,2. Te framställs av löv och knoppar av Woody perenna Camellia sinensis L. te plantor odlas i stora plantager och är mottagliga för många skade insekter3,4. Organophosphorus och neonikotinoid insekticider används ofta som systemiska insekticider5 för att skydda te plantor från skade djur som Whiteflies, Leaf Hoppers, och vissa fjärilsarter arter6,7. Efter applicering absorberas dessa insekticider eller translokaliseras till växten. Inom anläggningen kan dessa systemiska insekticider omvandlas genom hydrolys, oxidation eller Reduktions reaktioner av växtenzymer. Dessa omvandlings produkter kan vara mer polära och mindre giftiga än moder föreningarna. Men för vissa organofosater är bioaktiviteterna hos vissa produkter högre. Till exempel, acefat metaboliseras till den mer giftiga metamidofos8,9, och dimetoat till ometoat10,11. Växt metaboliska studier är därför viktiga för att bestämma ödet för ett bekämpnings medel inom en anläggning12.
Växt vävnads kulturer har visat sig vara en användbar plattform för undersökning av pesticider metabolism, med de identifierade metaboliterna liknar dem som finns i intakt växter13,14,15. Användningen av vävnads kulturer, särskilt cell SUS pensions kulturer, har flera fördelar. För det första kan experiment utföras fritt från mikroorganismer och på så sätt undvika inblandning av omvandling av bekämpnings medel eller nedbrytning av mikrober. För det andra, vävnads kulturen ger konsekvent material för användning när som helst. För det tredje, metaboliterna är lättare att extrahera från vävnads kulturer än från intakt växter, och vävnads kulturer har ofta färre interring föreningar och lägre komplexitet föreningar. Slutligen kan vävnads kulturer lättare användas för att jämföra en rad bekämpnings medels metabolism i ett enda experiment16.
I denna studie, en cell SUS pension härrör från bladen av steril-odlade te plantlet var framgångs rikt etablerat. Te cell SUS pensionen kulturen användes sedan för att jämföra skingrande beteenden av sex systemiska insekticider.
Detta detaljerade protokoll är avsett att ge viss vägledning så att forskarna kan etablera en växt vävnad kultur plattform användbar för att studera den metaboliska öde xenobiotika i te.
Denna artikel presenterar den detaljerade processen för att fastställa en modell av pesticider metabolism i te växt vävnad, inklusive val av explants, bestämning av cellernas livs kraft, och inrättandet av en te cell SUS pension kultur med hög metabolisk Aktivitet. Alla delar av en växt vävnad kan användas för att initiera förhårdnader i en steriliserad miljö25. Teblad valdes för förhårdnader initiering i denna studie, inte bara för att bladen tenderar att vara mindre förorenade…
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöddes av den nationella centrala forsknings & utvecklingsprogram (2016YFD0200900) i Kina, Kinas nationella naturvetenskaplig grund (nr 31772076 och nr 31270728), Kina post doktor Science Foundation (2018M630700), och öppna fonden för Statliga viktiga laboratoriet för Tea Plant biologi och utnyttjande (SKLTOF20180111).
Acetamiprid (99.8%) | Dr. Ehrenstorfer | 46717 | CAS No: 135410-20-7 |
Acetonitrile (CAN, 99.9%) | Tedia | AS1122-801 | CAS No: 75-05-8 |
Agar | Solarbio Science & Technology | A8190 | CAS No: 9002-18-0 |
Clothianidin (99.8%) | Dr. Ehrenstorfer | 525 | CAS No: 210880-92-5 |
Dimethoate (98.5%) | Dr. Ehrenstorfer | 109217 | CAS No: 60-51-5 |
Imidacloprid (99.8%) | Dr. Ehrenstorfer | 91029 | CAS No: 138261-41-3 |
Imidaclothiz (99.5%) | Toronto Research Chemical | I275000 | CAS No: 105843-36-5 |
Kinetin (KT, >98.0%) | Solarbio Science & Technology | K8010 | CAS No: 525-79-1 |
Omethoate (98.5%) | Dr. Ehrenstorfer | 105491 | CAS No: 1113-02-6 |
Polyvinylpolypyrrolidone (PVPP) | Solarbio Science & Technology | P8070 | CAS No: 25249-54-1 |
Sucrose | Tocris Bioscience | 5511 | CAS No: 57-50-1 |
Thiamethoxam (99.8%) | Dr. Ehrenstorfer | 20625 | CAS No: 153719-23-4 |
Triphenyltetrazolium Chloride (TTC, 98.0%) | Solarbio Science & Technology | T8170 | CAS No: 298-96-4 |
2,4-Dichlorophenoxyacetic Acid (2,4-D, >98.0%) | Guangzhou Saiguo Biotech | D8100 | CAS No: 94-75-7 |
chiral column | Agilent CYCLOSIL-B | 112-6632 | Chromatography column (30 m × 0.25 mm × 0.25 μm) |
Gas chromatography (GC) | Shimadu | 2010-Plus | Paired with Flame Photometric Detector (FPD) |
High-performance liquid chromatography (HPLC) | Agilent | 1260 | Paired with Ultraviolet detector (UV) |
HSS T3 C18 column | Waters | 186003539 | Chromatography column (100 mm × 2.1 mm × 1.8 μm) |
Ultra-high-performance liquid chromatography (UPLC) | Agilent | 1290-6545 | Tandem quadrupole time-of-flight mass spectrometer (QTOF) |
Ultra-high-performance liquid chromatography (UPLC) | Thermo Scientific | Ultimate 3000-Q Exactive Focus | Connected to a Orbitrap mass spectrometer |