In Vivo Inhibition of MicroRNA to Decrease Tumor Growth in Mice In Vivo Inhibition of MicroRNA to Decrease Tumor Growth in Mice In Vivo Inhibition of MicroRNA to Decrease Tumor Growth in Mice In Vivo
Summary
Ce protocole décrit les modèles de souris xénogreffes et orthotopiques de la tumorigénèse thyroïdienne humaine comme plate-forme pour tester des traitements inhibiteurs à base de microARN. Cette approche est idéale pour étudier la fonction des ARN non codants et leur potentiel en tant que nouvelles cibles thérapeutiques.
Abstract
Les microARN (miARN) sont d’importants régulateurs de l’expression génique grâce à leur capacité à déstabiliser l’ARNm et à inhiber la traduction des ARNc cibles. Un nombre sans cesse croissant d’études ont identifié les miARN comme des biomarqueurs potentiels pour le diagnostic et le pronostic du cancer, ainsi que comme des cibles thérapeutiques, ajoutant une dimension supplémentaire à l’évaluation et au traitement du cancer. Dans le contexte du cancer de la thyroïde, la tumorigénèse résulte non seulement de mutations dans des gènes importants, mais aussi de la surexpression de nombreux miARN. En conséquence, le rôle des miARN dans le contrôle de l’expression des gènes thyroïdiens évolue comme un mécanisme important dans le cancer. Ici, nous présentons un protocole pour examiner les effets de la livraison miRNA-inhibiteur comme modalité thérapeutique dans le cancer thyroïde utilisant le xénogreffe humain de tumeur et les modèles orthotopic de souris. Après l’ingénierie des cellules tumorales thyroïdiennes stables exprimant le GFP et la luciferase, les cellules sont injectées dans les souris nues pour développer des tumeurs, qui peuvent être suivies par la bioluminescence. L’inhibition in vivo d’un miRNA peut réduire la croissance tumorale et réguler les cibles du gène miRNA. Cette méthode peut être utilisée pour évaluer l’importance d’un miRNA déterminé in vivo, en plus d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques.
Introduction
Le cancer de la thyroïde est une malignité endocrinienne avec une incidence croissante, bien qu’en termes généraux il ait un bon résultat1. Néanmoins, certains patients développent des formes agressives de la maladie qui sont incurables et les bases moléculaires sont mal comprises2.
Les miARN sont des ARN non codants de 22 nucléotides qui régulent l’expression des gènes dans de nombreux tissus, généralement par liaison de base-paire à la région non translationnelle de 3′ (3’UTR) des ARN de messager cible (ARNM), déclenchant la dégradation de l’ARNm ou la répression translationnelle 3 (en) , 4. Il y a de plus en plus de preuves démontrant que la déréglementation de l’expression des microARN est une caractéristique du cancer, car ces molécules modulent la signalisation proliférante, la migration, l’invasion et la métastasie, et peuvent fournir une résistance à l’apoptose 5,6. Ces dernières années, de nombreuses études ont identifié les miARN comme des biomarqueurs potentiels pour le diagnostic et le pronostic du cancer ainsi que des cibles thérapeutiques7, fournissant une nouvelle dimension à l’évaluation et au traitement du cancer.
miRNAs ont pris le devant de la scène en oncologie moléculaire humaine en tant que moteurs clés des néoplasmes thyroïdiens humains8,9,10,11,12. Parmi les miRNAs up-regulated, miR-146b est fortement surexprimé dans les tumeurs de carcinome thyroïde papillaire (PTC) et a été montré pour augmenter de manière significative la prolifération cellulaire, et pour être associé à l’agressivité et au pronostic lamentable6, 12 Ans, états-unis , 13 (en) , 14 (en) , 15. En outre, miR-146b régule plusieurs gènes thyroïdiens impliqués dans la différenciation12, et aussi des gènes suppresseurs de tumeurs importants tels que PTEN16 et DICER117. Malgré leur importance dans la biologie du cancer, la thérapie contre le cancer à base de miARN en est encore à ses premiers stades, et très peu d’études ont abordé le cancer de la thyroïde – la plus fréquente des tumeurs endocriniennes18. Ici nous décrivons un protocole utilisant deux modèles différents de souris avec des tumeurs d’origine humaine, dans lequel l’administration d’un miRNA-inhibiteur synthétique (antagomiR) qui inhibe spécifiquement un miRNA cellulaire peut bloquer la croissance de tumeur. Nous avons d’abord employé un modèle commun de xénogreffe, et l’administration intratumorale locale d’une croissance diminuée de tumeur antagomiR mesurée comme réduction de la bioluminescence de tumeur16. Parce que l’établissement de modèles de souris robustes imitant la progression des tumeurs humaines est essentiel pour développer des approches thérapeutiques uniques, l’implantation orthotopique de tumeurs humaines primaires est une plate-forme plus précieuse pour la validation clinique de nouveaux médicaments que modèles d’implantation sous-cutanée. Ainsi, afin de mieux évaluer le potentiel thérapeutique de l’antagomiR, nous avons utilisé un modèle de souris orthotopic avec la livraison systémique dans la circulation sanguine, obtenant les mêmes résultats.
Protocol
Representative Results
Discussion
Cet article décrit une méthode pour étudier la fonction in vivo d’un miRNA afin de mieux comprendre son rôle dans l’initiation et la progression de tumeur, et son potentiel en tant que cible thérapeutique dans le cancer thyroïde. Les modèles de xénogreffe de tumeur décrits ici sont basés sur l’utilisation des cellules qui peuvent être suivies par leur signal de bioluminescence, permettant la mesure de la croissance de tumeur in vivo sous l’influence d’un traitement. En outre, nous décrivons l’utilisation d’un…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous sommes reconnaissants à Raquel Arocha Riesco pour son aide dans le traitement et les soins des souris. Nous remercions le Dr J. Blanco (Institut catalan pour la chimie avancée-CSIC) et le Dr E. Mato (Institut de Reserca de l’Hospital de la Santa Creu i Sant Pau) Barcelone (Espagne) pour avoir offert respectivement les cellules CMV-Firefly luc-IRES-EGFP et Cal62-Luc.
Materials
| AntagomiR: mirVana miRNA inhibitor | Thermo Fisher | 4464088 | In Vivo Ready |
| Basement Membrane Matrix: Matrigel Basement Membrane Matrix High Concentration | Corning | #354248 | |
| DICER antibody | Abcam | ab14601 | IHQ: 1/100 |
| In vivo delivery reagent: Invivofectamine 3.0 Reagent | Thermo Fisher | IVF3005 | |
| In vivo imaging software: IVIS-Lumina II Imaging System | Caliper Life Sciences | ||
| Negative control: mirVana miRNA Inhibitor, Negative Control #1 | Thermo Fisher | 4464077 | In Vivo Ready |
| PCNA antibody | Abcam | ab92552 | WB: 1/2,000 |
| PTEN antibody | Santa Cruz | sc-7974 | WB: 1/1,000 |
| XenoLight D-Luciferin – K+ Salt Bioluminescent Substrate | PerkinElmer | 122799 | Diluted in PBS |
Riferimenti
- Lim, H., Devesa, S. S., Sosa, J. A., Check, D., Kitahara, C. M. Trends in Thyroid Cancer Incidence and Mortality in the United States. Journal of the American Medical Association. 317 (13), 1338-1348 (2017).
- Landa, I., et al. Genomic and transcriptomic hallmarks of poorly differentiated and anaplastic thyroid cancers. The Journal of Clinical Investigation. 126 (3), 1052-1066 (2016).
- Gregory, R. I., Shiekhattar, R. MicroRNA biogenesis and cancer. Ricerca sul cancro. 65 (9), 3509-3512 (2005).
- Lin, S., Gregory, R. I. MicroRNA biogenesis pathways in cancer. Nature Reviews Cancer. 15 (6), 321-333 (2015).
- Hammond, S. M. MicroRNAs as oncogenes. Current Opinion In Genetics & Development. 16 (1), 4-9 (2006).
- Cancer Genome Atlas Reserch Network. Integrated genomic characterization of papillary thyroid carcinoma. Cell. 159 (3), 676-690 (2014).
- Li, Z., Rana, T. M. Therapeutic targeting of microRNAs: current status and future challenges. Nature Reviews. Drug Discovery. 13 (8), 622-638 (2014).
- Pallante, P., Battista, S., Pierantoni, G. M., Fusco, A. Deregulation of microRNA expression in thyroid neoplasias. Nature Reviews. Endocrinology. 10 (2), 88-101 (2014).
- Fuziwara, C. S., Kimura, E. T. MicroRNAs in thyroid development, function and tumorigenesis. Molecular and Cellular Endocrinology. 456, 44-50 (2017).
- Fuziwara, C. S., Kimura, E. T. MicroRNA Deregulation in Anaplastic Thyroid Cancer Biology. International Journal of Endocrinology. 2014, 743450 (2014).
- Riesco-Eizaguirre, G., Santisteban, P. Endocrine Tumours: Advances in the molecular pathogenesis of thyroid cancer: lessons from the cancer genome. European Journal of Endocrinology. 175 (5), R203-R217 (2016).
- Riesco-Eizaguirre, G., et al. The miR-146b-3p/PAX8/NIS Regulatory Circuit Modulates the Differentiation Phenotype and Function of Thyroid Cells during Carcinogenesis. Ricerca sul cancro. 75 (19), 4119-4130 (2015).
- Lima, C. R., Geraldo, M. V., Fuziwara, C. S., Kimura, E. T., Santos, M. F. MiRNA-146b-5p upregulates migration and invasion of different Papillary Thyroid Carcinoma cells. BMC Cancer. 16, 108 (2016).
- Lee, J. C., et al. MicroRNA-222 and microRNA-146b are tissue and circulating biomarkers of recurrent papillary thyroid cancer. Cancer. 119 (24), 4358-4365 (2013).
- Deng, X., et al. MiR-146b-5p promotes metastasis and induces epithelial-mesenchymal transition in thyroid cancer by targeting ZNRF3. Cellular Physiology and Biochemistry. International Journal of Experimental Cellular Physiology, Biochemistry, and Pharmacology. 35 (1), 71-82 (2015).
- Ramirez-Moya, J., Wert-Lamas, L., Santisteban, P. MicroRNA-146b promotes PI3K/AKT pathway hyperactivation and thyroid cancer progression by targeting PTEN. Oncogene. , (2018).
- Ramirez-Moya, J., Wert-Lamas, L., Riesco Eizaguirre, G., Santisteban, P. Impaired microRNA processing by DICER1 downregulation endows thyroid cancer with increased aggressiveness. Oncogene. , (2019).
- Xing, M. Molecular pathogenesis and mechanisms of thyroid cancer. Nature Reviews. Cancer. 13 (3), 184-199 (2013).
