Identifikation af Nukleolarfaktorer under HIV-1-replikation gennem rev-Immunopræcipitation og massespektrometri

Summary

Her beskriver vi rev immun præcipitation i nærværelse af HIV-1 replikation for massespektrometri. De beskrevne metoder kan anvendes til identifikation af nukleolarfaktorer, der er involveret i HIV-1-infektions cyklussen, og gælder for andre sygdomsmodeller til karakterisering af under studerede veje.

Abstract

HIV-1 infektiøse cyklus kræver viral protein interaktioner med værts faktorer for at lette viral replikation, emballering, og frigivelse. Den smitsomme cyklus kræver yderligere dannelsen af virale/Host-protein komplekser med HIV-1-RNA for at regulere splejningen og muliggøre nukleocytoplasmisk transport. HIV-1 rev-proteinet opnår den nukleare eksport af HIV-1 mRNAs gennem multimerisering med intronic CIS-virkende mål-den rev respons element (rre). Et nucleolar lokaliserings signal (NoLS) findes inden for COOH-endestation af det rev arginin-rige motiv (ARM), der tillader akkumulering af rev/RRE komplekser i nucleolus. Nucleolar faktorer er spekuleret til at støtte HIV-1 infektiøse cyklus gennem forskellige andre funktioner ud over at mætte mRNA-uafhængig nuklear eksport og splicing. Vi beskriver en chromatinimmunpræcipitation metode af vild-type (WT) rev i sammenligning med rev nucleolar mutationer (sletning og enkelt-punkt rev-Nols mutationer) i nærværelse af HIV-1 replikation for massespektrometri. Nukleolar faktorer impliceret i nukleocytoplasmic transport (nucleophosmin B23 og nucleolin C23), samt cellulære splejsning faktorer, mister interaktion med rev i nærværelse af rev-Nols mutationer. Forskellige andre nukleolar faktorer, såsom snoRNA C/D box 58, er identificeret til at miste interaktion med rev mutationer, men deres funktion i HIV-1 replikation cyklus forbliver ukendt. Resultaterne præsenteres her demonstrere brugen af denne metode til identifikation af virale/Host nucleolar faktorer, der opretholder HIV-1 infektiøse cyklus. De begreber, der anvendes i denne fremgangsmåde, gælder for andre virale og sygdomsmodeller, som kræver karakterisering af under studerede veje.

Introduction

Nucleolus postuleres som samspillet jorden af forskellige cellulære vært og virale faktorer, der kræves for viral replikation. Nucleolus er en kompleks struktur inddelt i tre forskellige rum: fibrillar-rummet, det tætte fibrillar-rum og det granulære rum. HIV-1 rev-proteinet lokaliserer specifikt i granulære rum; årsagen til dette lokaliserings mønster er dog ukendt. Ved tilstedeværelse af enkeltpunkts-mutationer inden for NoLS-sekvensen (rev-mutationer 4, 5 og 6) opretholder rev et nukleolært mønster og har tidligere vist sig at redde HIV-1_HXB2 -replikation, dog med nedsat effektivitet sammenlignet med WT rev¹ . Alle enkeltpunkts-mutationer kan ikke opretholde HIV-1_NL4-3- infektions cyklussen. I nærværelse af flere enkeltpunkts-mutationer inden for NoLS-sekvensen (rev-NoLS-mutationer 2 og 9) er rev blevet observeret for at sprede hele kernen og cytoplasmaet og har ikke været i stand til at redde HIV-1_HXB2 Replication¹. Målet med denne proteomics undersøgelse er at dechifrere nucleolar samt nonnucleolar cellulære faktorer involveret i den rev-medierede HIV-1 infektiøse pathway. Rev chromatinimmunpræcipitation betingelser er optimeret gennem interaktion med nucleolar B23 phosphoprotein, som tidligere har vist sig at miste interaktion med rev i nærværelse af nukleolar mutationer.

Rev cellulære faktorer er blevet grundigt undersøgt i fortiden; Men, dette er sket i fravær af viral patogenese. Et protein, især, der er karakteriseret i denne undersøgelse gennem rev interaktion under HIV-1 replikation er nucleolar glycosyleret B23-også kaldet nucleophosmin (NPM), numatrin, eller NO38 i padder²,^{3, 4}. B23 udtrykkes som tre isoformer (NPM1, NPM2 og NPM3)-alle medlemmer af nukleofsmin/nucleoplasmin Nuclear chaperone-familien^5,6. Den NPM1 molekylære chaperone funktioner i den korrekte samling af nukleosomer, i dannelsen af protein/nukleinsyre komplekser involveret i kromatin højere orden strukturer^7,8, og i forebyggelsen af aggregering og misfoldning af målproteiner gennem et N-terminal kerneområde (rester 1-120)⁹. NPM1 funktionalitet strækker sig til ribosom Genesis gennem transport af preribosomale partikler mellem kernen og cytoplasmaet^10,11, behandling af preribosomal RNA i den interne transkriberet spacer sekvens ^12,13, og arrestere nucleolar aggregering af proteiner under ribosomale assembly^14,15. NPM1 er impliceret i hæmning af apoptose¹⁶ og i stabilisering af tumor suppressorer ARF^17,18 og P53¹⁹, afslører sin dobbelte rolle som en onkogen faktor og tumor suppressor. NPM1 deltager i cellulære aktiviteter af genom stabilitet, centrosome replikation, og transskription. NPM1 findes i nucleoli under celle cyklus Interphase, langs den kromosomale periferi under mitose, og i prenucleolar organer (PNB) ved afslutningen af mitose. NPM2 og NPM3 er ikke så godt undersøgt som NPM1, som gennemgår ændrede ekspressionsniveauer under malignitet²⁰.

NPM1 er dokumenteret i nucleocytoplasmic fjer ning af forskellige nukleare/nukleolære proteiner gennem en intern NES og NLS^9,21 og blev tidligere rapporteret til at drive den nukleare import af HIV-1 TAT og rev proteiner. I nærværelse af B23-binding-domæne-β-galactosidase fusion proteiner, TAT mislocalizes inden for cytoplasmaet og mister transaktiverende aktivitet; Dette viser en stærk affinitet af TAT for B23². En anden undersøgelse etablerede en rev/B23 stabilt kompleks i fravær af RRE-holdige mRNAs. Ved tilstedeværelse af RRE mRNA dissocieres rev fra B23 og binder fortrinsvis til HIV RRE, hvilket fører til forskydning af B23²². Det er ukendt, hvor, på det subnukleare niveau, TAT transaktiveringen og rev udveksling processen af B23 for HIV mRNA finde sted. Begge proteiner postuleres for at komme ind i nucleolus samtidigt gennem B23 interaktion. Inddragelsen af andre Host cellulære proteiner i HIV-nukleolar pathway forventes. De metoder, der er beskrevet i denne proteomics undersøgelse vil hjælpe belyse samspillet mellem nucleolus med vært cellulære faktorer involveret under HIV-1 patogenese.

Proteomics-undersøgelsen blev indledt gennem ekspression af rev NoLS single-point mutationer (M4, M5 og M6) og flere arginin erstatninger (m2 og M9) for HIV-1_HXB2 produktion. I denne model, en Hela cellelinje stabilt udtrykker rev-mangelfuld HIV-1_HXB2 (hlfb) er transficeret med WT rev og rev nucleolar mutationer indeholdende en flag tag ved 3 ‘ ende. Tilstedeværelsen af WT rev vil gøre det muligt at forekomme viral replikering i HLfB-kulturen sammenlignet med rev-NoLS-mutationer, der ikke redder rev-mangel (m2 og M9), eller tillader viral replikering at forekomme, men ikke så effektivt som WT rev (M4, M5 og M6)¹. Celle lysatet opsamles 48 h senere efter viral proliferation ved tilstedeværelse af rev-ekspression og udsættes for immunopræcipitation med en lyse buffer, der er optimeret til rev/B23-interaktion. Lysis buffer optimering ved hjælp af varierende saltkoncentrationer er beskrevet, og protein elueringsmetoder for HIV-1 rev sammenlignes og analyseres i sølvfarvede eller Coomassie-farvede SDS-side geler. Den første proteomics-tilgang indebærer en direkte analyse af en elueret prøve fra udtrykt WT rev, m2, M6 og M9 ved tandem massespektrometri. En anden fremgangsmåde, hvormed eluaterne af WT rev, M4, M5 og M6 gennemgik en gel ekstraktionsproces, sammenlignes med den første metode. Peptidaffinitet til rev-NoLS-mutationer i forhold til WT rev analyseres, og sandsynligheden for protein identifikation vises. Disse tilgange afslører potentielle faktorer (nucleolar og nonnucleolar), der deltager i HIV-1 mRNA transport og splejning med rev under HIV-1 replikation. Samlet set er celle lysis, IP, og elueringsbetingelser, der er beskrevet, gældende for virale proteiner af interesse for forståelsen af vært cellulære faktorer, der aktiverer og regulerer smitsomme veje. Dette gælder også for studiet af cellulære Host faktorer, der kræves for persistens af forskellige sygdomsmodeller. I denne proteomics model, HIV-1 rev IP er optimeret til B23 interaktion at belyse nukleolar faktorer involveret i nucleocytoplasmic fjer-aktivitet og HIV-1 mRNA binding. Derudover, cellelinjer stabilt udtrykker smitsomme sygdomme modeller, der er mangelfuld for centrale proteiner af interesse kan udvikles, svarende til HLfB cellelinje, at studere infektiøse veje af interesse.

Protocol

1. cellekultur Vedligehold HLfB i Dulbecco’s modificerede Eagle’s medium (DMEM) suppleret med 10% føtal bovint serum (FBS), 2 mM L-glutamin og 1 mM natrium pyruvat inden for vævs-kultur-behandlede 100 mm plader. Opbevar cellekulturer ved 37 °C i en befuret inkubator forsynet med 5% CO2. Passage flydende celler til en celletæthed på 1 x 106 celler/ml. Kassér cellekultur mediet. Cellerne skylles forsigtigt med 10 mL 1x fosfat-bufferet saltvand (PBS). Fjern og kassér 1x PBS u…

Representative Results

Rev-NoLS single-og multiple-point arginin mutationer, svarende til en række subcellulære lokaliseringsmønstre, blev undersøgt i deres evne til at interagere med cellulære Host faktorer i forhold til WT rev. WT rev-3’flag og pcDNA-flag vektor blev udtrykt i HLfB kultur. Protein komplekser blev forarbejdet fra Total celle lysat og plettet med sølv plet reagens. Rev-NoLS-3’flaget er detekterbart (ca. 18 kDa) i tre forskellige lyse buffer forhold, der indeholder forskellige koncentrationer af NaCl (137 mM, 200…

Discussion

Massespektrometriske analyser, der sammenlignede rev-NoLS-mutationer og WT rev i tilstedeværelse af HIV-1, blev vurderet til at forstå nukleolarfaktorer, der var involveret i viral replikeringscyklussen. Dette vil identificere de nukleolarkomponenter, der er nødvendige for viral infektivitet. Nucleolar B23 har en høj affinitet til rev-NoLS og funktioner i nukleolar lokalisering af rev³ og nucleocytoplasmic transport af rev-bundet hiv mRNAs²². Affiniteten af B23 med rev-…

Materials

Acetic acid	Fisher Chemical	A38S-212
Acetonitrile	Fisher Chemical	A955-500
Acrylamide:Bisacrylamide	BioRad	1610158
Ammonium bicarbonate	Fisher Chemical	A643-500
Ammonium persulfate	Sigma-Aldrich	7727-54-0
ANTI-Flag M2 affinity gel	Sigma-Aldrich	A2220
anti-Flag M2 mouse monoclonal IgG	Sigma-Aldrich	F3165
BioMax MS film	Carestream	8294985
Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent Concentrate, 450 mL	Bio-Rad	5000006
B23 mouse monoclonal IgG	Santa Cruz Biotechnologies	sc-47725
Bromophenol blue	Sigma-Aldrich	B0126
Carnation non-fat powdered milk	Nestle	N/A
Cell scraper	ThermoFisher Scientific	179693PK
C18IonKey nanoTile column	Waters	186003763
Corning 100-mm TC-treated culture dishes	Fisher Scientific	08-772-22
Dithiothreitol	Thermo Scientific	J1539714
1 x DPBS	Corning	21-030-CVRS
ECL Estern blotting substrate	Pierce	32106
Ethanol, 200 proof	Fisher Chemical	A409-4
FBS	Gibco	16000044
Formic Acid	Fisher Chemical	A117-50
GelCode blue stain reagent	ThermoFisher	24590
Glycerol	Fisher Chemical	56-81-5
goat-anti-mouse IgG-HRP	Santa Cruz Biotechnologies	sc-2005
Iodoacetamide	ACROS Organics	122270050
KimWipe delicate task wiper	Kimberly Clark Professional	34120
L-glutamine	Gibco	25030081
Methanol	Fisher Chemical	67-56-1
NanoAcuity UPLC	Waters	N/A
Pierce Silver Stain Kit	Thermo Scientific	24600df
15-mL Polypropylene conical tube	Falcon	352097
Prestained Protein Ladder, 10 to 180 kDa	Thermo Scientific	26616
Protease inhibitor cocktail	Roche	4693132001
Purified BSA	New England Biolabs	B9001
PVDF  Western blotting membrane	Roche	3010040001
Sodium Pyruvate	Gibco	11360070
10 x TBS	Fisher Bioreagents	BP2471500
TEMED	BioRad	1610880edu
Triton X-100 detergent solution	BioRad	1610407
Trizaic source	Waters	N/A
trypsin-EDTA	Corning	25-051-CIS
Tween 20	BioRad	1706531
Synapt G2 mass spectrometer	Waters	N/A
Whatman filter paper	Tisch Scientific	10427813