Identifisering av Nucleolar faktorer under HIV-1-replikering gjennom rev Immunutfelling og Mass massespektrometri

Summary

Her beskriver vi rev immunutfelling i nærvær av HIV-1 replikering for masse massespektrometri. Metodene som er beskrevet kan brukes for identifisering av nucleolar faktorer involvert i HIV-1 smittsomme syklusen og gjelder for andre sykdoms modeller for karakterisering av lite studert trasé.

Abstract

Den HIV-1 smittsomme syklusen krever viral protein interaksjoner med verten faktorer for å lette viral replikering, emballasje, og slipp. Den smittsomme syklusen ytterligere krever dannelsen av viral/vert protein komplekser med HIV-1 RNA å regulere skjøting og aktivere nucleocytoplasmic transport. HIV-1 rev protein oppnår kjernefysisk eksport av HIV-1 mRNAs gjennom multimerization med intronic CIS-fungerende mål-rev respons element (RRE). En nucleolar lokalisering signal (NoLS) finnes innenfor COOH-Terminus av rev Arginine-rike motiv (ARM), slik at akkumulering av rev/RRE komplekser i nucleolus. Nucleolar faktorer er spekulert å støtte HIV-1 smittsomme syklus gjennom ulike andre funksjoner i tillegg til formidling mRNA-uavhengig kjernefysisk eksport og skjøting. Vi beskriver en immunutfelling metode av vill-type (WT) rev i forhold til rev nucleolar mutasjoner (sletting og single-point rev-NoLS mutasjoner) i nærvær av HIV-1 replikering for masse massespektrometri. Nucleolar faktorer innblandet i nucleocytoplasmic transport (nucleophosmin B23 og nucleolin C23), samt cellulære skjøting faktorer, mister interaksjon med rev i nærvær av rev-NoLS mutasjoner. Ulike andre nucleolar faktorer, for eksempel snoRNA C/D-boksen 58, er identifisert for å miste interaksjon med rev mutasjoner, men deres funksjon i HIV-1 replikering syklusen forblir ukjent. Resultatene som presenteres her demonstrere bruken av denne tilnærmingen for identifisering av viral/vert nucleolar faktorer som opprettholder HIV-1 smittsomme syklusen. Begrepene som brukes i denne tilnærmingen er gjeldende for andre viral og sykdom modeller som krever karakterisering av lite studert trasé.

Introduction

Den nucleolus er postulert som samspillet bakken av ulike mobilnettet vert og viral faktorer som kreves for viral replikering. Nucleolus er en kompleks struktur inndelt i tre forskjellige rom: fibrillær rommet, det tette fibrillær rommet og det detaljerte rommet. HIV-1 rev protein lokaliseres spesielt innenfor kornet avdelinger; årsaken til dette lokaliserings mønsteret er imidlertid ukjent. I nærvær av single-point mutasjoner innenfor NoLS sekvensen (rev mutasjoner 4, 5 og 6), rev opprettholder et nucleolar mønster og har tidligere vist å redde HIV-1_HXB2 replikering, men med redusert effektivitet i forhold til WT rev¹ . Alle single-point mutasjoner er ikke i stand til å opprettholde HIV-1_NL4-3 smittsomme syklusen. I nærvær av flere single-point mutasjoner innenfor NoLS sekvensen (rev-NoLS mutasjoner 2 og 9), rev har blitt observert å spre hele kjernen og cytoplasma og har ikke vært i stand til å redde HIV-1_HXB2 Replication¹. Målet med denne Proteomikk studien er å dechiffrere nucleolar så vel som nonnucleolar cellulære faktorer involvert i rev-mediert HIV-1 smittsomme veien. Rev immunutfelling forhold er optimalisert gjennom interaksjon med nucleolar B23 phosphoprotein, som tidligere har vist å miste interaksjon med rev i nærvær av nucleolar mutasjoner.

Rev cellulære faktorer har blitt grundig studert i det siste; Men, dette har blitt gjort i fravær av viral patogenesen. Ett protein, spesielt, som er karakterisert ved denne studien gjennom rev interaksjon under HIV-1 replikering er nucleolar phosphoprotein B23-også kalt nucleophosmin (NPM), numatrin eller NO38 i amfibier²,^{3, 4}. B23 uttrykkes som tre isoformene (NPM1, NPM2 og NPM3)-alle medlemmer av nucleophosmin/nucleoplasmin kjernefysiske Anstandsdame familie^5,6. Den NPM1 molekylære Anstandsdame funksjoner i riktig montering av nucleosomes, i dannelsen av protein/nukleinsyre acid komplekser involvert i kromatin høyere orden strukturer^7,8, og i forebygging av aggregering og misfolding av mål proteiner gjennom et N-Terminal kjerne domene (rester 1-120)⁹. NPM1 funksjonalitet strekker seg til ribosom Genesis gjennom transport av preribosomal partikler mellom kjernen og cytoplasma^10,11, behandling av preribosomal RNA i den interne transkribere spacer sekvensen ^12,13, og arrestere den nucleolar aggregering av proteiner under ribosomal forsamlingen^14,15. NPM1 er innblandet i Hemming av apoptose¹⁶ og i stabilisering av tumor Suppressors Arf^17,18 og p53¹⁹, avslører sin dual rolle som en kreftfremkallende faktor og tumor Suppressor. NPM1 deltar i mobilnettet aktiviteter av Genova stabilitet, centrosome replikering, og transkripsjon. NPM1 er funnet i nucleoli under celle syklus Interphase, langs kromosom periferien under mitose, og i prenucleolar organer (PNB) ved avslutningen av mitose. NPM2 og NPM3 er ikke så godt studert som NPM1, som gjennomgår endrede uttrykks nivåer under kreft²⁰.

NPM1 er dokumentert i nucleocytoplasmic skytteltrafikk av ulike kjernefysiske/nucleolar proteiner gjennom en intern NES og NLS^9,21 og ble tidligere rapportert å drive kjernefysisk import av HIV-1 TAT og rev proteiner. I nærvær av B23-bindende-domene-β-galaktosidase Fusion proteiner, TAT mislocalizes innenfor cytoplasma og mister transactivation aktivitet; Dette demonstrerer en sterk affinitet av TAT for B23². En annen studie etablerte en rev/B23 stabilt kompleks i fravær av RRE-inneholder mRNAs. I nærvær av RRE mRNA, rev dissociates fra B23 og binder fortrinnsvis til HIV RRE, fører til forskyvning av B23²². Det er ukjent hvor, på subnuclear nivå, TAT transactivation og rev utveksle prosessen med B23 for HIV mRNA finner sted. Begge proteinene er postulert å gå inn i nucleolus samtidig gjennom B23 interaksjon. Involvering av andre vert cellulære proteiner i HIV nucleolar veien er forventet. Metodene som er beskrevet i denne Proteomikk undersøkelsen vil bidra til å belyse samspillet mellom nucleolus med verts cellulære faktorer involvert under HIV-1-patogenesen.

Den Proteomikk etterforskningen ble initiert gjennom uttrykk for rev NoLS enkelt punkt mutasjoner (M4, M5, og M6) og flere Arginine erstatninger (M2 og M9) for HIV-1_HXB2 produksjon. I denne modellen, en jakten cellelinje stabilt uttrykker rev-mangelfull HIV-1_HXB2 (HLfB) er TRANSFEKTERTE med WT rev og rev nucleolar mutasjoner som inneholder et flagg merke på 3 ‘ end. Tilstedeværelsen av WT rev vil tillate viral replikering til å skje i HLfB kultur, i forhold til rev-NoLS mutasjoner som ikke redde rev mangel (M2 og M9), eller tillate viral replikering til å skje, men ikke så effektivt som WT rev (M4, M5, og M6)¹. Cellen lysat samles 48 h senere etter viral spredning i nærvær av rev uttrykk og utsatt for immunutfelling med en lyseringsbuffer optimalisert for rev/B23 interaksjon. Lyseringsbuffer optimalisering ved hjelp av varierende salt konsentrasjoner er beskrevet, og protein eluering metoder for HIV-1 rev blir sammenlignet og analysert i sølv-farget eller Coomassie-farget SDS-PAGE gels. Den første Proteomikk tilnærmingen innebærer direkte analyse av en eluert prøve fra uttrykt WT rev, m2, M6 og M9 ved tandem masse massespektrometri. En annen tilnærming der eluates av WT rev, M4, M5 og M6 gjennomgikk en gel utvinningsprosess sammenlignes med den første tilnærmingen. Peptid affinitet til rev-NoLS mutasjoner i forhold til WT rev analyseres og protein identifikasjon sannsynlighet vises. Disse tilnærmingene avslører potensielle faktorer (nucleolar og nonnucleolar) som deltar i HIV-1 mRNA transport og skjøting med rev under HIV-1 replikering. Total, cellen lyse, IP, og eluering vilkårene beskrevet er anvendelig på viral protein av interesse for forståelsen av vert Cellular faktorene det aktivere og regulere infeksjon trasé. Dette gjelder også for studiet av mobilnettet vert faktorer som kreves for utholdenhet av ulike sykdoms modeller. I denne Proteomikk modellen, HIV-1 rev IP er optimalisert for B23 interaksjon til belyse nucleolar faktorer involvert i nucleocytoplasmic skytteltrafikk aktivitet og HIV-1 mRNA bindende. I tillegg, cellelinjer stabilt uttrykker smittsomme sykdommer modeller som er mangelfull for viktige proteiner av interesse kan utvikles, ligner på HLfB cellelinje, for å studere smittsomme stier av interesse.

Protocol

1. cellekultur Opprettholde HLfB i Dulbecco ‘ s modifiserte Eagle ‘ s medium (DMEM) supplert med 10% fosterets storfe serum (FBS), 2 mM L-glutamin, og 1 mM natrium pyruvat innen vev-kultur-behandlet 100 mm plater. Hold celle kulturen ved 37 ° c i en fuktet inkubator som leveres med 5% CO2. Passage confluent celler til en celle tetthet på 1 x 106 celler/ml. Forkast cellekultur mediene. Skyll forsiktig cellene med 10 mL 1x fosfat-bufret saltvann (PBS). Fjern og Forkast 1x PBS ute…

Representative Results

Rev-NoLS enkelt-og flere-punkts Arginine mutasjoner, som tilsvarer en rekke subcellulære lokalisering mønstre, ble undersøkt i deres evne til å samhandle med mobilnettet vert faktorer i forhold til WT rev. WT rev-3’flag og pcDNA-Flag vektor ble uttrykt i HLfB kultur. Protein komplekser ble behandlet fra total celle lysat og beiset med sølv flekk reagens. Rev-NoLS-3’flag er synlig (ca. 18 kDa) i tre forskjellige lyseringsbuffer forhold som inneholder ulike konsentrasjoner av NaCl (137 mM, 200 mM, og 300 mM) …

Discussion

Masse spectrometric analyser sammenligne rev-NoLS mutasjoner og WT rev i nærvær av HIV-1 ble vurdert til å forstå nucleolar faktorer involvert i viral replikering syklus. Dette vil identifisere nucleolar komponenter som kreves for viral infectivity. Nucleolar B23 har en høy affinitet til rev-NoLS og funksjoner i Nucleolar lokalisering av rev³ og nucleocytoplasmic transport av rev-bundet HIV mRNAs²². Affinitet av B23 med rev-NoLS mutasjoner, som inneholdt én eller fler…

Materials

Acetic acid	Fisher Chemical	A38S-212
Acetonitrile	Fisher Chemical	A955-500
Acrylamide:Bisacrylamide	BioRad	1610158
Ammonium bicarbonate	Fisher Chemical	A643-500
Ammonium persulfate	Sigma-Aldrich	7727-54-0
ANTI-Flag M2 affinity gel	Sigma-Aldrich	A2220
anti-Flag M2 mouse monoclonal IgG	Sigma-Aldrich	F3165
BioMax MS film	Carestream	8294985
Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent Concentrate, 450 mL	Bio-Rad	5000006
B23 mouse monoclonal IgG	Santa Cruz Biotechnologies	sc-47725
Bromophenol blue	Sigma-Aldrich	B0126
Carnation non-fat powdered milk	Nestle	N/A
Cell scraper	ThermoFisher Scientific	179693PK
C18IonKey nanoTile column	Waters	186003763
Corning 100-mm TC-treated culture dishes	Fisher Scientific	08-772-22
Dithiothreitol	Thermo Scientific	J1539714
1 x DPBS	Corning	21-030-CVRS
ECL Estern blotting substrate	Pierce	32106
Ethanol, 200 proof	Fisher Chemical	A409-4
FBS	Gibco	16000044
Formic Acid	Fisher Chemical	A117-50
GelCode blue stain reagent	ThermoFisher	24590
Glycerol	Fisher Chemical	56-81-5
goat-anti-mouse IgG-HRP	Santa Cruz Biotechnologies	sc-2005
Iodoacetamide	ACROS Organics	122270050
KimWipe delicate task wiper	Kimberly Clark Professional	34120
L-glutamine	Gibco	25030081
Methanol	Fisher Chemical	67-56-1
NanoAcuity UPLC	Waters	N/A
Pierce Silver Stain Kit	Thermo Scientific	24600df
15-mL Polypropylene conical tube	Falcon	352097
Prestained Protein Ladder, 10 to 180 kDa	Thermo Scientific	26616
Protease inhibitor cocktail	Roche	4693132001
Purified BSA	New England Biolabs	B9001
PVDF  Western blotting membrane	Roche	3010040001
Sodium Pyruvate	Gibco	11360070
10 x TBS	Fisher Bioreagents	BP2471500
TEMED	BioRad	1610880edu
Triton X-100 detergent solution	BioRad	1610407
Trizaic source	Waters	N/A
trypsin-EDTA	Corning	25-051-CIS
Tween 20	BioRad	1706531
Synapt G2 mass spectrometer	Waters	N/A
Whatman filter paper	Tisch Scientific	10427813