Här beskriver vi rev immunoprecipitation i närvaro av HIV-1 replikering för masspektrometri. De beskrivna metoderna kan användas för att identifiera nukleolära faktorer som är involverade i den infektiösa HIV-1-cykeln och är tillämpliga på andra sjukdomsmodeller för karakterisering av understuderade vägar.
HIV-1 infektiös cykel kräver viral protein interaktioner med värd faktorer för att underlätta viral replikering, förpackning, och frisättning. Den smittsamma cykeln ytterligare kräver bildandet av viral/Host proteinkomplex med HIV-1-RNA för att reglera skarvning och möjliggöra nukleocytoplasmic transport. HIV-1 rev protein åstadkommer kärn exporten av HIV-1 mRNAs genom multimerization med intronic CIS-verkande mål-rev Response element (rre). En nukleolär lokalisering signal (NoLS) finns inom COOH-Terminus av Rev arginin-rika motiv (ARM), vilket gör att ansamling av Rev/RRE komplex i Nukleolus. Nucleolar faktorer spekuleras för att stödja HIV-1 infektiös cykel genom olika andra funktioner förutom medhjälp mRNA-oberoende kärnkraft export och splitsning. Vi beskriver en immunoprecipitation metod av Wild-Type (WT) rev i jämförelse med rev nukleolära mutationer (borttagande och Single-Point rev-NoLS mutationer) i närvaro av HIV-1 replikering för masspektrometri. Nukleolära faktorer inblandade i nukleocytoplasmic transport (nucleophosmin B23 och nukleolin C23), samt cellulära skarvning faktorer, förlorar interaktion med rev i närvaro av Rev-NoLS mutationer. Olika andra nukleolära faktorer, såsom snoRNA C/D Box 58, identifieras för att förlora interaktion med rev mutationer, men deras funktion i HIV-1 replikering cykel förblir okända. De resultat som presenteras här visar användningen av denna metod för identifiering av virala/värd nukleolära faktorer som upprätthåller HIV-1 infektiös cykel. Begreppen som används i denna metod är tillämpliga på andra virala och sjukdomsmodeller som kräver karakterisering av understuderade vägar.
Den Nukleolus är postuleras som interaktions grunden för olika cellulära värden och virala faktorer som krävs för viral replikering. Den Nukleolus är en komplex struktur indelad i tre olika fack: den fibrillar facket, den täta fibrillar facket, och den granulat facket. HIV-1 rev protein lokaliserar specifikt inom granulat fack; orsaken till det här lokaliserings mönstret är dock okänt. I närvaro av Single-Point mutationer inom NOLS sekvens (rev mutationer 4, 5, och 6), rev upprätthåller ett nukleolära mönster och har tidigare visat sig rädda hiv-1ande HXB2 replikering, dock, med minskad effektivitet jämfört med WT rev1 . Alla Single-Point mutationer är oförmögna att upprätthålla HIV-1NL4-3 infektiös cykel. I närvaro av flera Single-Point mutationer inom NoLS sekvens (rev-NoLS mutationer 2 och 9), rev har observerats för att skingra hela kärnan och cytoplasman och har inte kunnat rädda HIV-1ande HXB2 replikering1. Målet med denna proteomik studie är att dechiffrera nukleolar samt nonnucleolar cellulära faktorer inblandade i rev-medierad HIV-1 smittsam väg. Rev immunoprecipitation villkor optimeras genom interaktion med nukleolära B23 Phosphoprotein, som tidigare har visat sig förlora interaktion med rev i närvaro av nukleolära mutationer.
Rev cellulära faktorer har studerats utförligt i det förflutna; emellertid, detta har gjorts i avsaknad av viral patogenes. Ett protein, i synnerhet, som kännetecknas i denna studie genom rev interaktion under hiv-1 replikering är den nukleolära fosfoprotein B23-även kallad nukleofobi (NPM), numatrin, eller NO38 i amfibier2,3, 4. B23 uttrycks som tre isoformer (NPM1, NPM2, och NPM3)-alla medlemmar av nukleoforsmin/nukleokplasmin kärn-förkläde familj5,6. Den NPM1 molekylära förkläde funktioner i rätt sammansättning av nukleosomer, i bildandet av protein/nukleinsyra komplex inblandade i kromatin högre ordningens strukturer7,8, och i förebyggande av aggregering och felaktig uppfällning av målproteiner genom en N-Terminal kärn domän (rester 1-120)9. NPM1 funktionalitet sträcker sig till Ribosomen Genesis genom transport av preribosomala partiklar mellan kärnan och cytoplasman10,11, behandling av preribosomalt RNA i den interna transkriberade spacer sekvens 12,13, och arrestera nukleolära aggregering av proteiner under ribosomal församling14,15. NPM1 är inblandad i hämning av apoptos16 och i stabiliseringen av tumörsuppressorer ARF17,18 och p5319, avslöjar dess dubbla roll som en onkogen faktor och tumör suppressor. NPM1 deltar i cellulära aktiviteter av genomstabilitet, centrosom replikering, och transkription. NPM1 finns i nukleolerna under cellcykeln Interphase, längs kromosomala periferin under Mitos, och i prenukleolar organ (PNB) vid avslutningen av Mitosen. NPM2 och NPM3 är inte lika väl studerade som NPM1, som genomgår förändrade uttrycks nivåer under malignitet20.
NPM1 dokumenteras i nukleocytoplasmic shuttling av olika nukleära/nukleolära proteiner genom en intern NES och nls9,21 och rapporterades tidigare att driva den nukleära importen av hiv-1 tat och rev proteiner. I närvaro av B23-binding-domän-β-galaktosidas fusion proteiner, tat mislocalizes inom cytoplasman och förlorar transactivation aktivitet; Detta visar en stark affinitet av TAT för B232. En annan studie etablerat en rev/B23 stabil komplex i avsaknad av RRE-innehållande mRNAs. I närvaro av RRE mRNA, rev separerar från B23 och binder företrädesvis till HIV RRE, vilket leder till förskjutning av B2322. Det är okänt var, på subnukleär nivå, tat transaktivering och rev Exchange-processen för B23 för HIV mRNA äga rum. Båda proteiner antas för att komma in i Nukleolus samtidigt genom B23 interaktion. Medverkan av andra värd cellulära proteiner i hiv nukleolära vägen väntas. De metoder som beskrivs i denna proteomik undersökning kommer att bidra till att belysa samspelet mellan Nukleolus med värd cellulära faktorer inblandade under HIV-1 patogenes.
Den proteomik undersökningen inleddes genom uttrycket av Rev NoLS Single-Point mutationer (M4, M5, och M6) och multipla arginin substitutioner (m2 och M9) för HIV-1ande HXB2 produktion. I denna modell, en hela cell linje stabilt uttrycker rev-brist hiv-1ande HXB2 (hlfb) är transfekterade med WT rev och rev nukleolära mutationer som innehåller en flagga tagg vid 3 ‘ End. Närvaron av WT rev kommer att tillåta viral replikering inträffa i HLfB kultur, i jämförelse med rev-NoLS mutationer som inte rädda rev-brist (m2 och M9), eller tillåta viral replikering inträffa men inte lika effektivt som WT rev (M4, M5, och M6)1. Cellen lysate samlas 48 h senare efter viral proliferation i närvaro av Rev uttryck och utsätts för immunoprecipitation med en lysis buffert optimerad för rev/B23 interaktion. Lyseringsbuffert optimering med varierande saltkoncentrationer beskrivs, och proteinelueringmetoder för HIV-1 Rev jämförs och analyseras i silver-färgade eller Coomassie-färgade SDS-PAGE Gels. Den första proteomikmetoden innebär direkt analys av ett eluerat prov från uttryckta WT rev, m2, M6 och M9 av tandem masspektrometri. En andra metod som eluater av WT rev, M4, M5 och M6 genomgick en gel utvinning process jämförs med den första metoden. Peptid tillhörighet till rev-NoLS-mutationer i jämförelse med WT rev analyseras och sannolikheten för protein identifiering visas. Dessa metoder avslöjar potentiella faktorer (nukleolar och nonnucleolar) som deltar i HIV-1 mRNA transport och skarvning med rev under HIV-1 replikering. Sammantaget är de beskrivna cell Lys-, IP-och elutionsförhållandena tillämpliga på virala proteiner av intresse för förståelsen av värden cellulära faktorer som aktiverar och reglerar smittsamma vägar. Detta är också tillämplig på studier av cellulära värden faktorer som krävs för persistens av olika sjukdomsmodeller. I denna proteomik modell, HIV-1 rev IP är optimerad för B23 interaktion för att belysa nukleolära faktorer inblandade i nukleocytoplasmic shuttling aktivitet och HIV-1 mRNA bindning. Dessutom, cellinjer stabilt uttrycker infektionssjukdomar modeller som är bristfällig för viktiga proteiner av intresse kan utvecklas, liknande HLfB cell linjen, att studera smittsamma vägar av intresse.
Masspektrometriska analyser som jämförde rev-NoLS-mutationer och WT rev i närvaro av HIV-1 utvärderades för att förstå nukleolära faktorer involverade i virusets replikeringscykel. Detta skulle identifiera nukleolära komponenter som krävs för viral smittsamhet. Nukleolära B23 har en hög affinitet till rev-NOLS och funktioner i nukleolära lokalisering av Rev3 och nukleocytoplasmic transport av Rev-bunden hiv mrnas22. Affinitet av B23 med rev-NoLS mutationer, so…
The authors have nothing to disclose.
Författarna erkänner Dr Barbara K. Felber och Dr George N. Pavlakis för HLfB anhängare kultur som tillhandahålls av National Institutes of Health (NIH) AIDS forskning och referens reagens program, avdelningen för AIDS, National Institute of allergi och infektiösa Sjukdomar (NIAID), NIH. Författarna erkänner också finansiella källor som tillhandahålls av NIH, bidrag AI042552 och AI029329.
Acetic acid | Fisher Chemical | A38S-212 | |
Acetonitrile | Fisher Chemical | A955-500 | |
Acrylamide:Bisacrylamide | BioRad | 1610158 | |
Ammonium bicarbonate | Fisher Chemical | A643-500 | |
Ammonium persulfate | Sigma-Aldrich | 7727-54-0 | |
ANTI-Flag M2 affinity gel | Sigma-Aldrich | A2220 | |
anti-Flag M2 mouse monoclonal IgG | Sigma-Aldrich | F3165 | |
BioMax MS film | Carestream | 8294985 | |
Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent Concentrate, 450 mL | Bio-Rad | 5000006 | |
B23 mouse monoclonal IgG | Santa Cruz Biotechnologies | sc-47725 | |
Bromophenol blue | Sigma-Aldrich | B0126 | |
Carnation non-fat powdered milk | Nestle | N/A | |
Cell scraper | ThermoFisher Scientific | 179693PK | |
C18IonKey nanoTile column | Waters | 186003763 | |
Corning 100-mm TC-treated culture dishes | Fisher Scientific | 08-772-22 | |
Dithiothreitol | Thermo Scientific | J1539714 | |
1 x DPBS | Corning | 21-030-CVRS | |
ECL Estern blotting substrate | Pierce | 32106 | |
Ethanol, 200 proof | Fisher Chemical | A409-4 | |
FBS | Gibco | 16000044 | |
Formic Acid | Fisher Chemical | A117-50 | |
GelCode blue stain reagent | ThermoFisher | 24590 | |
Glycerol | Fisher Chemical | 56-81-5 | |
goat-anti-mouse IgG-HRP | Santa Cruz Biotechnologies | sc-2005 | |
Iodoacetamide | ACROS Organics | 122270050 | |
KimWipe delicate task wiper | Kimberly Clark Professional | 34120 | |
L-glutamine | Gibco | 25030081 | |
Methanol | Fisher Chemical | 67-56-1 | |
NanoAcuity UPLC | Waters | N/A | |
Pierce Silver Stain Kit | Thermo Scientific | 24600df | |
15-mL Polypropylene conical tube | Falcon | 352097 | |
Prestained Protein Ladder, 10 to 180 kDa | Thermo Scientific | 26616 | |
Protease inhibitor cocktail | Roche | 4693132001 | |
Purified BSA | New England Biolabs | B9001 | |
PVDF Western blotting membrane | Roche | 3010040001 | |
Sodium Pyruvate | Gibco | 11360070 | |
10 x TBS | Fisher Bioreagents | BP2471500 | |
TEMED | BioRad | 1610880edu | |
Triton X-100 detergent solution | BioRad | 1610407 | |
Trizaic source | Waters | N/A | |
trypsin-EDTA | Corning | 25-051-CIS | |
Tween 20 | BioRad | 1706531 | |
Synapt G2 mass spectrometer | Waters | N/A | |
Whatman filter paper | Tisch Scientific | 10427813 |