Identifiering av nukleolära faktorer under HIV-1-replikation genom rev immunoprecipitation och masspektrometri

Summary

Här beskriver vi rev immunoprecipitation i närvaro av HIV-1 replikering för masspektrometri. De beskrivna metoderna kan användas för att identifiera nukleolära faktorer som är involverade i den infektiösa HIV-1-cykeln och är tillämpliga på andra sjukdomsmodeller för karakterisering av understuderade vägar.

Abstract

HIV-1 infektiös cykel kräver viral protein interaktioner med värd faktorer för att underlätta viral replikering, förpackning, och frisättning. Den smittsamma cykeln ytterligare kräver bildandet av viral/Host proteinkomplex med HIV-1-RNA för att reglera skarvning och möjliggöra nukleocytoplasmic transport. HIV-1 rev protein åstadkommer kärn exporten av HIV-1 mRNAs genom multimerization med intronic CIS-verkande mål-rev Response element (rre). En nukleolär lokalisering signal (NoLS) finns inom COOH-Terminus av Rev arginin-rika motiv (ARM), vilket gör att ansamling av Rev/RRE komplex i Nukleolus. Nucleolar faktorer spekuleras för att stödja HIV-1 infektiös cykel genom olika andra funktioner förutom medhjälp mRNA-oberoende kärnkraft export och splitsning. Vi beskriver en immunoprecipitation metod av Wild-Type (WT) rev i jämförelse med rev nukleolära mutationer (borttagande och Single-Point rev-NoLS mutationer) i närvaro av HIV-1 replikering för masspektrometri. Nukleolära faktorer inblandade i nukleocytoplasmic transport (nucleophosmin B23 och nukleolin C23), samt cellulära skarvning faktorer, förlorar interaktion med rev i närvaro av Rev-NoLS mutationer. Olika andra nukleolära faktorer, såsom snoRNA C/D Box 58, identifieras för att förlora interaktion med rev mutationer, men deras funktion i HIV-1 replikering cykel förblir okända. De resultat som presenteras här visar användningen av denna metod för identifiering av virala/värd nukleolära faktorer som upprätthåller HIV-1 infektiös cykel. Begreppen som används i denna metod är tillämpliga på andra virala och sjukdomsmodeller som kräver karakterisering av understuderade vägar.

Introduction

Den Nukleolus är postuleras som interaktions grunden för olika cellulära värden och virala faktorer som krävs för viral replikering. Den Nukleolus är en komplex struktur indelad i tre olika fack: den fibrillar facket, den täta fibrillar facket, och den granulat facket. HIV-1 rev protein lokaliserar specifikt inom granulat fack; orsaken till det här lokaliserings mönstret är dock okänt. I närvaro av Single-Point mutationer inom NOLS sekvens (rev mutationer 4, 5, och 6), rev upprätthåller ett nukleolära mönster och har tidigare visat sig rädda hiv-1_{ande HXB2} replikering, dock, med minskad effektivitet jämfört med WT rev¹ . Alla Single-Point mutationer är oförmögna att upprätthålla HIV-1_NL4-3 infektiös cykel. I närvaro av flera Single-Point mutationer inom NoLS sekvens (rev-NoLS mutationer 2 och 9), rev har observerats för att skingra hela kärnan och cytoplasman och har inte kunnat rädda HIV-1_{ande HXB2} replikering¹. Målet med denna proteomik studie är att dechiffrera nukleolar samt nonnucleolar cellulära faktorer inblandade i rev-medierad HIV-1 smittsam väg. Rev immunoprecipitation villkor optimeras genom interaktion med nukleolära B23 Phosphoprotein, som tidigare har visat sig förlora interaktion med rev i närvaro av nukleolära mutationer.

Rev cellulära faktorer har studerats utförligt i det förflutna; emellertid, detta har gjorts i avsaknad av viral patogenes. Ett protein, i synnerhet, som kännetecknas i denna studie genom rev interaktion under hiv-1 replikering är den nukleolära fosfoprotein B23-även kallad nukleofobi (NPM), numatrin, eller NO38 i amfibier^{2,3, 4}. B23 uttrycks som tre isoformer (NPM1, NPM2, och NPM3)-alla medlemmar av nukleoforsmin/nukleokplasmin kärn-förkläde familj^5,6. Den NPM1 molekylära förkläde funktioner i rätt sammansättning av nukleosomer, i bildandet av protein/nukleinsyra komplex inblandade i kromatin högre ordningens strukturer^7,8, och i förebyggande av aggregering och felaktig uppfällning av målproteiner genom en N-Terminal kärn domän (rester 1-120)⁹. NPM1 funktionalitet sträcker sig till Ribosomen Genesis genom transport av preribosomala partiklar mellan kärnan och cytoplasman^10,11, behandling av preribosomalt RNA i den interna transkriberade spacer sekvens ¹²,¹³, och arrestera nukleolära aggregering av proteiner under ribosomal församling^14,15. NPM1 är inblandad i hämning av apoptos¹⁶ och i stabiliseringen av tumörsuppressorer ARF^17,18 och p53¹⁹, avslöjar dess dubbla roll som en onkogen faktor och tumör suppressor. NPM1 deltar i cellulära aktiviteter av genomstabilitet, centrosom replikering, och transkription. NPM1 finns i nukleolerna under cellcykeln Interphase, längs kromosomala periferin under Mitos, och i prenukleolar organ (PNB) vid avslutningen av Mitosen. NPM2 och NPM3 är inte lika väl studerade som NPM1, som genomgår förändrade uttrycks nivåer under malignitet²⁰.

NPM1 dokumenteras i nukleocytoplasmic shuttling av olika nukleära/nukleolära proteiner genom en intern NES och nls^9,21 och rapporterades tidigare att driva den nukleära importen av hiv-1 tat och rev proteiner. I närvaro av B23-binding-domän-β-galaktosidas fusion proteiner, tat mislocalizes inom cytoplasman och förlorar transactivation aktivitet; Detta visar en stark affinitet av TAT för B23². En annan studie etablerat en rev/B23 stabil komplex i avsaknad av RRE-innehållande mRNAs. I närvaro av RRE mRNA, rev separerar från B23 och binder företrädesvis till HIV RRE, vilket leder till förskjutning av B23²². Det är okänt var, på subnukleär nivå, tat transaktivering och rev Exchange-processen för B23 för HIV mRNA äga rum. Båda proteiner antas för att komma in i Nukleolus samtidigt genom B23 interaktion. Medverkan av andra värd cellulära proteiner i hiv nukleolära vägen väntas. De metoder som beskrivs i denna proteomik undersökning kommer att bidra till att belysa samspelet mellan Nukleolus med värd cellulära faktorer inblandade under HIV-1 patogenes.

Den proteomik undersökningen inleddes genom uttrycket av Rev NoLS Single-Point mutationer (M4, M5, och M6) och multipla arginin substitutioner (m2 och M9) för HIV-1_{ande HXB2} produktion. I denna modell, en hela cell linje stabilt uttrycker rev-brist hiv-1_{ande HXB2} (hlfb) är transfekterade med WT rev och rev nukleolära mutationer som innehåller en flagga tagg vid 3 ‘ End. Närvaron av WT rev kommer att tillåta viral replikering inträffa i HLfB kultur, i jämförelse med rev-NoLS mutationer som inte rädda rev-brist (m2 och M9), eller tillåta viral replikering inträffa men inte lika effektivt som WT rev (M4, M5, och M6)¹. Cellen lysate samlas 48 h senare efter viral proliferation i närvaro av Rev uttryck och utsätts för immunoprecipitation med en lysis buffert optimerad för rev/B23 interaktion. Lyseringsbuffert optimering med varierande saltkoncentrationer beskrivs, och proteinelueringmetoder för HIV-1 Rev jämförs och analyseras i silver-färgade eller Coomassie-färgade SDS-PAGE Gels. Den första proteomikmetoden innebär direkt analys av ett eluerat prov från uttryckta WT rev, m2, M6 och M9 av tandem masspektrometri. En andra metod som eluater av WT rev, M4, M5 och M6 genomgick en gel utvinning process jämförs med den första metoden. Peptid tillhörighet till rev-NoLS-mutationer i jämförelse med WT rev analyseras och sannolikheten för protein identifiering visas. Dessa metoder avslöjar potentiella faktorer (nukleolar och nonnucleolar) som deltar i HIV-1 mRNA transport och skarvning med rev under HIV-1 replikering. Sammantaget är de beskrivna cell Lys-, IP-och elutionsförhållandena tillämpliga på virala proteiner av intresse för förståelsen av värden cellulära faktorer som aktiverar och reglerar smittsamma vägar. Detta är också tillämplig på studier av cellulära värden faktorer som krävs för persistens av olika sjukdomsmodeller. I denna proteomik modell, HIV-1 rev IP är optimerad för B23 interaktion för att belysa nukleolära faktorer inblandade i nukleocytoplasmic shuttling aktivitet och HIV-1 mRNA bindning. Dessutom, cellinjer stabilt uttrycker infektionssjukdomar modeller som är bristfällig för viktiga proteiner av intresse kan utvecklas, liknande HLfB cell linjen, att studera smittsamma vägar av intresse.

Protocol

1. cell odling Upprätthålla HLfB i Dulbecco modifierade Eagle ‘ s medium (DMEM) kompletteras med 10% foster bovint serum (FBS), 2 mM L-glutamin, och 1 mM natrium pyruvat inom vävnad-kultur-behandlade 100 mm plattor. Håll cellkulturerna vid 37 ° c i en fuktad inkubator som levereras med 5% CO2. Passage konfluenta celler till en celltäthet av 1 x 106 celler/ml. Kassera cell odlingsmediet. Skölj cellerna varsamt med 10 mL 1x fosfatbuffrad saltlösning (PBS). Ta bort och kasse…

Representative Results

Rev-NoLS Single-och multipel-punkt arginin-mutationer, som motsvarar en mängd olika subcellulära lokaliserings mönster, undersöktes i deras förmåga att interagera med cellulära värd faktorer i jämförelse med WT rev. WT rev-3 ‘ Flag och pcDNA-Flag vektor uttrycktes i HLfB-kultur. Protein komplex behandlades från total cell lysate och färgas med silver fläck reagens. Rev-NoLS-3 ‘ Flag är detekterbar (ca 18 kDa) i tre olika lysis buffert villkor som innehåller olika koncentrationer av NaCl (137 mM, 2…

Discussion

Masspektrometriska analyser som jämförde rev-NoLS-mutationer och WT rev i närvaro av HIV-1 utvärderades för att förstå nukleolära faktorer involverade i virusets replikeringscykel. Detta skulle identifiera nukleolära komponenter som krävs för viral smittsamhet. Nukleolära B23 har en hög affinitet till rev-NOLS och funktioner i nukleolära lokalisering av Rev³ och nukleocytoplasmic transport av Rev-bunden hiv mrnas²². Affinitet av B23 med rev-NoLS mutationer, so…

Materials

Acetic acid	Fisher Chemical	A38S-212
Acetonitrile	Fisher Chemical	A955-500
Acrylamide:Bisacrylamide	BioRad	1610158
Ammonium bicarbonate	Fisher Chemical	A643-500
Ammonium persulfate	Sigma-Aldrich	7727-54-0
ANTI-Flag M2 affinity gel	Sigma-Aldrich	A2220
anti-Flag M2 mouse monoclonal IgG	Sigma-Aldrich	F3165
BioMax MS film	Carestream	8294985
Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent Concentrate, 450 mL	Bio-Rad	5000006
B23 mouse monoclonal IgG	Santa Cruz Biotechnologies	sc-47725
Bromophenol blue	Sigma-Aldrich	B0126
Carnation non-fat powdered milk	Nestle	N/A
Cell scraper	ThermoFisher Scientific	179693PK
C18IonKey nanoTile column	Waters	186003763
Corning 100-mm TC-treated culture dishes	Fisher Scientific	08-772-22
Dithiothreitol	Thermo Scientific	J1539714
1 x DPBS	Corning	21-030-CVRS
ECL Estern blotting substrate	Pierce	32106
Ethanol, 200 proof	Fisher Chemical	A409-4
FBS	Gibco	16000044
Formic Acid	Fisher Chemical	A117-50
GelCode blue stain reagent	ThermoFisher	24590
Glycerol	Fisher Chemical	56-81-5
goat-anti-mouse IgG-HRP	Santa Cruz Biotechnologies	sc-2005
Iodoacetamide	ACROS Organics	122270050
KimWipe delicate task wiper	Kimberly Clark Professional	34120
L-glutamine	Gibco	25030081
Methanol	Fisher Chemical	67-56-1
NanoAcuity UPLC	Waters	N/A
Pierce Silver Stain Kit	Thermo Scientific	24600df
15-mL Polypropylene conical tube	Falcon	352097
Prestained Protein Ladder, 10 to 180 kDa	Thermo Scientific	26616
Protease inhibitor cocktail	Roche	4693132001
Purified BSA	New England Biolabs	B9001
PVDF  Western blotting membrane	Roche	3010040001
Sodium Pyruvate	Gibco	11360070
10 x TBS	Fisher Bioreagents	BP2471500
TEMED	BioRad	1610880edu
Triton X-100 detergent solution	BioRad	1610407
Trizaic source	Waters	N/A
trypsin-EDTA	Corning	25-051-CIS
Tween 20	BioRad	1706531
Synapt G2 mass spectrometer	Waters	N/A
Whatman filter paper	Tisch Scientific	10427813