Una strategia per identificare i composti che influenzano la crescita cellulare e la sopravvivenza nelle cellule di mammaliana coltivate a bassa-moderato throughput

Sommario

Spesso è necessario valutare la potenziale citotossicità di un insieme di composti sulle cellule coltivate. Qui, descriviamo una strategia per lo screening affidabile dei composti tossici in un formato di 96 pozze.

Abstract

La citotossicità è un parametro critico che deve essere quantificato quando si studiano farmaci che possono avere benefici terapeutici. Per questo motivo, molti saggi di screening farmacologico utilizzano la citotossicità come una delle caratteristiche critiche da profilare per i singoli composti. Le cellule nella coltura sono un modello utile per valutare la citotossicità prima di procedere a seguire composti di piombo promettenti in modelli animali più costosi e ad alta intensità di lavoro. Descriviamo una strategia per identificare i composti che influenzano la crescita cellulare in una linea di tdTomato che esprime cellule staminali neurali umane (NSC). La strategia utilizza due saggi complementari per valutare il numero di cellulare. Un saggio funziona attraverso la riduzione di 3-(4,5-dimetilthizol-2-yl)-2-diphenyltetrazolium bromuro (MTT) a formazan come proxy per il numero di cellulare e l'altro conta direttamente il tdTomato che esprime NSC. I due saggi possono essere eseguiti contemporaneamente in un unico esperimento e non sono laboriosi, rapidi e poco costosi. La strategia descritta in questa dimostrazione ha testato 57 composti in uno schermo primario esplorativo per la tossicità in un formato di piastra di 96 pozze. Tre dei colpi sono stati ulteriormente caratterizzati in una risposta alla dose di sei punti utilizzando lo stesso set-up assay come lo schermo primario. Oltre a fornire un'eccellente corroborazione per la tossicità, il confronto dei risultati dei due saggi può essere efficace nell'identificare i composti che interessano altri aspetti della crescita cellulare.

Introduzione

Una delle caratteristiche più importanti che deve essere determinata per un composto chimico che ha un potenziale terapeutico è la sua tossicità per le cellule animali. Questa caratteristica determinerà se un farmaco è un buon candidato per uno studio più ampio. Nella maggior parte dei casi, si cercano composti con tossicità minima, ma ci sono situazioni in cui un composto con la capacità di uccidere specifici tipi di cellule è di interesse, ad esempio, farmaci anti-tumigenici. Anche se gli animali interi sono i migliori sistemi modello per determinare la tossicità sistemica, il costo e la manodopera coinvolti sono proibitivi quando più di un paio di composti devono e....

Protocollo

1. Cultura NSC

NOTA: La manipolazione di una linea NSC umana verrà descritta di seguito, ma qualsiasi linea cellulare può essere utilizzata per questo protocollo. Tutto il lavoro di coltura cellulare viene eseguito in un armadietto di sicurezza biologica.

1. Cappotto una piastra di 96 pozzetto con membrana seminterrato/matrice extracellulare (ECM).
   1. Scongelare l'aliquota di ECM (Tabella dei materiali), che faciliterà l'attaccamento di NSC, sul ghiaccio. Diluire l'ECM alla concentrazione appropriata (generalmente 1:100) nel mezzo di base di 10 mL (Tabella dei materiali) e aggiungere 50 L per po....

Risultati

I dati automatizzati del conteggio delle cellule hanno identificato undici composti con minore del 25% di fattibilità quando vengono normalizzati al controllo DMSO, mentre i dati MTT identificavano questi stessi composti più due ulteriori (Tabella 1 e Tabella 2, rosso scuro). I due composti trovati tossici solo nell'esempio MTT (pozzi F3 e G10) avevano rispettivamente il 31% e il 39%, il numero di cellule tdTomato-positive come controllo e per ordine di rango erano i successivi due compo.......

Discussione

L'obiettivo principale di questo articolo era descrivere una strategia in grado di identificare in modo efficiente e conveniente i composti che influenzano la crescita delle cellule in uno screening a bassa o moderata velocità effettiva. Sono state utilizzate due tecniche ortogonali per valutare il numero di cellule per aumentare la fiducia nelle conclusioni e offrire ulteriori approfondimenti che non sarebbero disponibili se fosse stato utilizzato un solo saggio. Uno dei saggi ha usato un imager cellulare fluorescente p.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
B-27 (50X)	ThermoFisher Scientific	17504001	Componente del mezzo di cellule staminali neurali.
pipettatore da banco	Sorenson Bioscience	73990	Offre la possibilità di pipettare una libreria di composti in una piastra a 96 pozzetti in un colpo solo.
BioLite 96 pozzetti multipiatto	Thermo Scientific 130188		Qualsiasi piastra di coltura cellulare a 96 pozzetti funzionerà. Li usiamo nel nostro lavoro.
Microscopio per colture cellulari	Nikon	Eclipse TS100	Ispezione visiva delle cellule per garantire la corretta densità.
Cytation 5/ Lettore di imaging	BioTek	Utilizzato per l'imaging cellulare e le letture dell'assorbanza.
DMSO	Fisher Scientific	610420010	Solvente per composti utilizzati nello schermo. Dissolve i precipitati MTT per facilitare le misure di assorbanza.
FGF-basic	Peprotech	100-18B	Componente del mezzo di cellule staminali neurali.
GelTrex	ThermoFisher Scientific	A1413202	Matrice della membrana basale delle cellule staminali neurali. Consente alle cellule di attaccarsi alle piastre di coltura cellulare.
di analisi BioTek		Gen5 3.04	per determinare la conta cellulare per le cellule che esprimono tdTomato.
Glutammina	ThermoFisher Scientific	25030081	Componente del mezzo delle cellule staminali neurali.
Microtest U-Bottom	Becton Dickinson	3077	Archiviazione di librerie di composti.
MTT	ThermoFisher Scientific	M6494	Reagente per test attivo per determinare la vitalità cellulare.
Pippette multicanale	Rainin	E8-1200	Aggiunta colonna per colonna di terreno di coltura cellulare, MTT o DMSO.
Terreno neurobasale	ThermoFisher Scientific	21103049	Terreno di base per cellule staminali neurali.
Cubo filtrante RFP	BioTek	1225103	Filter in Cytation 5 utilizzato per visualizzare le cellule che esprimono tdTomato.
TrypLE	ThermoFisher Scientific	12605036	Reagente per dissociazione cellulare.

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