Eine Strategie zur Identifizierung von Verbindungen, die das Zellwachstum und das Überleben in kultivierten Säugetierzellen bei niedrigem bis moderatem Durchsatz beeinflussen
Summary
Es ist oft notwendig, die potenzielle Zytotoxizität einer Reihe von Verbindungen auf kultivierten Zellen zu bewerten. Hier beschreiben wir eine Strategie, um auf toxische Verbindungen zuverlässig im 96-Well-Format zu überprüfen.
Abstract
Zytotoxizität ist ein kritischer Parameter, der quantifiziert werden muss, wenn Medikamente untersucht werden, die therapeutische Vorteile haben können. Aus diesem Grund, viele Arzneimittel-Screening-Assays nutzen Zytotoxizität als eine der kritischen Eigenschaften für einzelne Verbindungen profiliert werden. Zellen in kultur sind ein nützliches Modell, um die Zytotoxizität zu bewerten, bevor sie vielversprechende Bleiverbindungen in teureren und arbeitsintensiveren Tiermodellen weiterverfolgen. Wir beschreiben eine Strategie zur Identifizierung von Verbindungen, die das Zellwachstum in einer tdTomato-exemitzenten menschlichen neuronalen Stammzellenlinie (NSC) beeinflussen. Die Strategie verwendet zwei ergänzende Assays, um die Zellzahl zu bewerten. Ein Assay funktioniert über die Reduktion von 3-(4,5-dimethylthizol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid (MTT) zu Formazan als Proxy für die Zellzahl und der andere zählt direkt die tdTomato-exemitten NSCs. Die beiden Assays können gleichzeitig in einem einzigen Experiment durchgeführt werden und sind nicht arbeitsintensiv, schnell und kostengünstig. Die in dieser Demonstration beschriebene Strategie testete 57 Verbindungen in einem explorativen Primärbildschirm auf Toxizität in einem 96-Well-Plattenformat. Drei der Treffer wurden weiter in einer Sechs-Punkt-Dosis-Antwort mit dem gleichen Assay-Setup wie der primäre Bildschirm charakterisiert. Neben der hervorragenden Bestätigung der Toxizität kann der Vergleich der Ergebnisse der beiden Assays auch bei der Identifizierung von Verbindungen, die andere Aspekte des Zellwachstums beeinflussen, wirksam sein.
Introduction
Eines der wichtigsten Merkmale, die für eine chemische Verbindung mit therapeutischem Potenzial bestimmt werden müssen, ist ihre Toxizität für tierische Zellen. Diese Eigenschaft wird bestimmen, ob ein Medikament ein guter Kandidat für eine umfassendere Studie ist. In den meisten Fällen werden Verbindungen mit minimaler Toxizität gesucht, aber es gibt Situationen, in denen eine Verbindung mit der Fähigkeit, bestimmte Zelltypen abzutöten, von Interesse ist, z. B. antitumorgene Medikamente. Obwohl ganze Tiere die besten Modellsysteme sind, um die systemische Toxizität zu bestimmen, sind die Damit verbundenen Kosten und Arbeitsstoffe unerschwinglich, wenn mehr als ein paar Verbindungen getestet werden müssen. Als solche Säugetierzellkultur wird in der Regel als die effizienteste Alternativeverwendet 1,2. Kleine bis mittlere Durchsatz-Drogen-Screens sind eine wichtige Modalität, durch die Toxizität in der Zellkultur beurteilt werden kann. Diese Bildschirme können verwendet werden, um annotierte Bibliotheken abzuhören, die auf einzelne Signalwege abzielen. Das allgemeine Format eines solchen Bildschirms besteht darin, zunächst alle Verbindungen in der Bibliothek in einer Einzeldosis (in der Regel 10 M) in einem explorativen primären Toxizitätsbildschirm zu testen und dann einen tiefen Sekundärdosis-Reaktionsbildschirm durchzuführen, um die Toxizität vollständig zu charakterisieren. Profil der Treffer vom primären Bildschirm. Die Methoden zur Umsetzung dieser Strategie werden hier beschrieben und bieten eine schnelle, effiziente und kostengünstige Möglichkeit, toxische Verbindungen zu identifizieren und zu charakterisieren.
Mehrere Methoden wurden entwickelt, um die Zytotoxizität kleiner Verbindungen und Nanomaterial in Säugetierzellen3,4zu bewerten. Es sollte beachtet werden, dass bestimmte Materialien mit dem Test interagieren können, der irreführende Ergebnisse liefert, und solche Wechselwirkungen sollten bei der Charakterisierung von Treffern von Toxizitätsbildschirmen getestet werden4. Zytotoxizitäts-Assays umfassen Trypanblau-Ausschluss5, Lactat-Dehydrogenase (LDH) Freisetzungstest6, Alamar blue assay7, calcien acetoxymethyl ester (AM)8, und der ATP-Assay9. Alle diese Assays messen verschiedene Aspekte des Zellstoffwechsels, die als Proxy für die Zellzahl dienen können. Während alle Vorteile bieten, Tetrazoliumsalz-basierte Assays wie 3-(4,5-Dimethylthizol-2-yl)-2,5-Diphenyltetrazoliumbromid (MTT), 2,3-bis(2-methoxy-4-nitro-5-sulfopheny)-2H-Tetrazolium-5-carboxyaniliid Iodophenyl]-2-[4-nitrophenyl]-2H-5-tetrazolio)-1,3-benzoldisulfonat (WST-1)10,11 bieten eine gute Genauigkeit und Benutzerfreundlichkeit bei niedrigen Kosten. MTT, das in dieser Demonstration verwendet wird, wird durch eine mitochondriale Reduktase auf ein unlösliches Formazan reduziert, und die Rate dieser Umwandlung korreliert stark mit der Zellzahl. Dieser Assay wurde routinemäßig sowohl in kleinem Maßstab als auch für Screening-Bibliotheken mit bis zu 2.000 Verbindungen12verwendet. Die direkte Zählung von Zellen durch einen markierten Marker bietet eine weitere Methode zur Bewertung der Zellzahl, und im Gegensatz zum MTT-Assay kann es zusätzliche Informationen über die Dynamik des Zellwachstums liefern. Mehrere öffentlich verfügbare Algorithmen stehen zur Verfügung, um automatisierte Zellzählanalysen durchzuführen, und es gibt auch proprietäre Algorithmen, die Teil von Softwarepaketen für Imaging-Reader13,14sind. In dieser Methodenbeschreibung dient eine menschliche neuronale Stammzelllinie (NSC), die genetisch so bearbeitet wurde, dass tdTomato15 konstitutiv ausdrückt, als Testlinie, um die Ergebnisse der zellulären Lebensfähigkeit zwischen einem MTT-Assay und einer automatisierten Zellzählung zu vergleichen. Test in einem Sieb zur Beurteilung der Toxizität von 57 Prüfverbindungen. Obwohl das primäre Ziel dieser Strategie war, toxische Verbindungen zu identifizieren und zu charakterisieren, hat es den zusätzlichen Vorteil der potenziell identifizierenwachstumshemmenden und wachstumsfördernden Verbindungen und bietet somit eine wirksame Methode zur Identifizierung von Medikamenten die das zelluläre Wachstum modulieren können.
Protocol
Representative Results
Discussion
Das primäre Ziel dieses Artikels war es, eine Strategie zu beschreiben, die Verbindungen, die das Zellwachstum beeinflussen, effizient und kostengünstig in einem Screening mit niedrigem bis moderatem Durchsatz identifizieren könnte. Zwei orthogonale Techniken wurden verwendet, um die Zellzahl zu bewerten, um das Vertrauen in die Schlussfolgerungen zu erhöhen und zusätzliche Erkenntnisse zu bieten, die nicht verfügbar wären, wenn nur ein einziger Test verwendet würde. Einer der Assays verwendete einen fluoresziere…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde vom NINDS Intramural Research Program unterstützt.
Materials
| B-27 (50X) | ThermoFisher Scientific | 17504001 | Neural stem cell medium component. |
| BenchTop pipettor | Sorenson Bioscience | 73990 | Provides ability to pipette compound library into a 96-well plate in one shot. |
| BioLite 96 well multidish | Thermo Scientific | 130188 | Any 96 well cell culture plate will work. We use these in our work. |
| Cell culture microscope | Nikon | Eclipse TS100 | Visual inspection of cells to ensure proper density. |
| Cytation 5/ Imaging reader | BioTek | CYT3MFV | Used for cell imaging and absorbance readings. |
| DMSO | Fisher Scientific | 610420010 | Solvent for compounds used in screen. Dissolves MTT precipitates to facilitate absorbance measurements. |
| FGF-basic | Peprotech | 100-18B | Neural stem cell medium component. |
| GelTrex | ThermoFisher Scientific | A1413202 | Neural stem cell basement membrane matrix. Allows cells to attach to cell culture plates. |
| Gen5 3.04 | BioTek | Analysis software to determine cell counts for tdTomato expressing cells. | |
| Glutamine | ThermoFisher Scientific | 25030081 | Neural stem cell medium component. |
| Microtest U-Bottom | Becton Dickinson | 3077 | Storage of compound libraries. |
| MTT | ThermoFisher Scientific | M6494 | Active assay reagent to determine cellular viability. |
| Multichannel pippette | Rainin | E8-1200 | Column-by-column addition of cell culture medium, MTT, or DMSO. |
| Neurobasal medium | ThermoFisher Scientific | 21103049 | Neural stem cell base medium. |
| RFP filter cube | BioTek | 1225103 | Filter in Cytation 5 used to image tdTomato expressing cells. |
| TrypLE | ThermoFisher Scientific | 12605036 | Cell dissociation reagent. |
Riferimenti
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