Gamete kollektion og in vitro befrugtning af Astyanax mexicanus
Summary
In vitro fertilisering er en almindeligt anvendt teknik med en række model organismer til at opretholde Lab populationer og producere synkroniserede embryoner til downstream-applikationer. Her præsenterer vi en protokol, der implementerer denne teknik til forskellige populationer af den mexicanske Tetra fisk, Astyanax mexicanus.
Abstract
Astyanax mexicanus er ved at dukke op som en model organisme for en række forskningsområder inden for biologisk videnskab. En del af den nylige succes med denne teleost fiskearter er, at det besidder interfertile hule og flod-bolig populationer. Dette muliggør genetisk kortlægning af arvelige træk, der blev fastsat under tilpasningen til de forskellige miljøer af disse populationer. Mens denne art kan opretholdes og opdrættes i laboratoriet, er det udfordrende at både få embryoner i dagtimerne og skabe hybrid embryoner mellem stammer. In vitro fertilisering (IVF) har været anvendt med en række forskellige model organismer til succes og gentagne gange opdrætte dyr i laboratoriet. I denne protokol viser vi hvordan, ved at akklimatisisere A. mexicanus til forskellige lyscyklusser kombineret med ændringer i vandtemperaturen, kan vi skifte avls cyklusser til et valgt tidspunkt på dagen. Efterfølgende viser vi, hvordan man identificerer egnede FORÆLDREFISK, indsamler sunde kønsceller fra mænd og kvinder og producerer levedygtige afkom ved hjælp af IVF. Dette gør det muligt at finde relaterede procedurer såsom injektion af genetiske konstruktioner eller udviklingsanalyse i normal arbejdstid. Desuden kan denne teknik bruges til at skabe hybrider mellem hulen og overflade-bolig populationer, og dermed gøre det muligt at studere den genetiske basis for fænotypiske tilpasninger til forskellige miljøer.
Introduction
I de seneste år, Astyanax mexicanus er blevet en model organisme i forskellige områder såsom udviklingsmæssige biologi, evolutionær biologi, adfærdsmæssige biologi, og fysiologi1,2,3,4 . Det unikke ved dette system kommer fra denne art, der har flere morfotyper, der har tilpasset til meget forskellige miljøer. Overfladen bolig morfotype bor i floder, hvor der er høj biodiversitet og masser af fødevarer kilder til fisken. I modsætning hertil, hulen morfotyper af A. mexicanus, cavefish, bor i huler, hvor biodiversitet, fødekilder, og ilt er drastisk formindsket1. Cavefish adskiller sig fra overfladen fisk i en række af fænotyper såsom fravær af øjne og pigmentering, insulinresistens, og evnen til at opbevare fedt2,3,4. Men overflade fisk og hule fisk tilhører stadig de samme arter og er derfor forstyrrende.
For begge morfotyper er der defineret et sæt betingelser, der muliggør rutinemæssig vedligeholdelse og avl under laboratorieforhold5,6. Imidlertid er genetiske modifikationer, egentlige embryonale udviklingsstudier og skabelse af hybrider stadig udfordrende af flere årsager. A. mexicanus Spawn primært i nattetimerne, hvilket er ubelejligt for efterfølgende eksperimenter på tidlige embryonale stadier såsom injektion af genetiske konstruktioner eller overvågning af tidlige embryonale udviklingsmæssige processer. Desuden er generering af overflade-og hule hybrider udfordrende ved hjælp af naturlig gydning, da hulen morfotyperne har en ændret døgnrytme7 , som i sidste ende påvirker produktionen af levedygtige æg. Vellykkede, men invasive, IVF procedurer er blevet beskrevet for andre Astyanax arter, hvor gamet produktion og gyde adfærd blev primet ved hjælp af hormonelle injektioner8,9. Mindre invasive IVF-procedurer (dvs. opnåelse af gameter fra manuel gydning uden injektion af hormonelle præparater) er blevet beskrevet, men mener ikke, at forskellene i gyde cyklussen mellem hule og overflade morfotyper af A. mexicanus 6.
Andre fisk model organismer, såsom zebrafish, kan nemt blive genetisk modificeret og undersøgt på et foster niveau, fordi de ovenfor anførte forhindringer er blevet løst. Gennemførelse af standardiserede avlsteknikker, in vitro befrugtning, og sperm kryopræservering har alle skubbet Zebra frem og solidificeret modellens anvendelse i biologisk videnskab10. Derfor, udvide disse teknikker til en. mexicanus vil yderligere styrke det som et model system.
Her præsenterer vi en detaljeret protokol for IVF, der vil bidrage til at gøre en. mexicanus mere tilgængelig. Vi vil præsentere en avl setup, der gør det muligt at flytte lysets cykler af fiskene fra dagtimerne til natten, så levedygtige æg kan opnås i løbet af dagen timer uden injektion af hormonelle præparater. Vi giver derefter en detaljeret beskrivelse af, hvordan man får de æg og milt, der anvendes til IVF. Denne metode vil gøre det muligt at fremstille embryoner i normal arbejdstid og gøre yderligere downstream-anvendelser mere gennemførlige sammenlignet med anvendelse af embryoner fra naturlig gyde.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mens IVF er en standardiseret metode til mange forskellige model organismer såsom zebrafish, eksisterende protokoller for a. mexicanus tager ikke hensyn til, at denne art naturligt gyder i løbet af natten timer6. I betragtning af at cavefish og overflade fisk afviger ganske drastisk i deres døgnrytme, varierer modnings cyklussen af æg også mellem hulen og overfladen morfotypes. Mens de midlertidige temperaturer og tider for overflade A. mexicanus er godt undersøgt<sup class…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne vil gerne takke Philippe Noguera og Kimberly Bland for deres støtte på video produktion. Forfatterne vil også gerne anerkende hele Aquatics-teamet i Stowers-instituttet for husdyrhold. Dette arbejde blev støttet af institutionel støtte til DPB og NR. NR blev støttet af Edward Mallinckrodt Foundation og JDRF. RP fik støtte fra Deutsche Forschungsgemeinschaft (PE 2807/1-1).
Materials
| 0.6 mL Centrifuge Tube | Eppendorf | #22364111 | |
| 100 mm Petri Dishes | VWR International | #25384-302 | |
| Aspirator Tube | Drummond | #2-000-000 | |
| Calibrated 1-5 µL Capillary Tubes | Drummond | #2-000-001 | |
| Dispolable Spatulas | VWR International | #80081-188 | |
| HMA-50S 50W Aquatic Heaters | Finnex | HMA-50S | |
| P1000 Pipette | Eppendorf | #3123000063 | |
| P1000 Pipette Tips | Thermo Scientific | #2079E | |
| Sanyo MIR-554 incubator | Panasonic Health Care | MIR-554-PA | |
| Sperm Extender E400 | 130 mM KCl, 50 mM NaCl, 2 mM CaCl2 (2H2O), 1 mM MgSO4 (7H2O), 10 mM D (+)-Glucose, 30 mM HEPES Adjust to pH 7.9 with 5M KOH and filter sterilize. Solution can be stored at 4 ˚C for up to 6 months. |
||
| Sponge Animal Holder | Made from scrap foam | ||
| System Water | Deionized water supplemented with Instant Ocean Sea Salt [Blacksburg, VA] to reach a specific conductance of 800 µS/cm. Water quality parameters are maintained within safe limits (Upper limit of total ammonia nitrogen range, 1 mg/L; upper limit of nitrite range, 0.5 mg/L; upper limit of nitrate range, 60 mg/L; temperature, 22 °C; pH, 7.65; dissolved oxygen 100 %) | ||
| Tissue Wipes | Kimberly-Clark Professional | #21905-026 | |
| ZIRC E2 Embryo Media | 15 mM NaCl, 0.5 mM KCl, 1.0 mM MgSO4, 150 µM KH2PO4, 50 µM Na2HPO4, 1.0 mM CaCl2, 0.7 mM NaHCO3. Adjust pH to 7.2 to 7.4 using 2 N hydrochloric acid. Filter sterilize. Stored at room temperature for a maximum of two weeks. |
Riferimenti
- Jeffery, W. R. Regressive evolution in Astyanax cavefish. Annual Review Genetics. 43, 25-47 (2009).
- Gross, J. B., Borowsky, R., Tabin, C. J. A novel role for Mc1r in the parallel evolution of depigmentation in independent populations of the cavefish Astyanax mexicanus. PLoS Genetics. 5, e1000326 (2009).
- Riddle, M. R., et al. Insulin resistance in cavefish as an adaptation to a nutrient-limited environment. Nature. 555, 647-651 (2018).
- Xiong, S., Krishnan, J., Peuß, R., Rohner, N. Early adipogenesis contributes to excess fat accumulation in cave populations of Astyanax mexicanus. Biologia dello sviluppo. 441 (2), 297-304 (2018).
- Borowsky, R. Breeding Astyanax mexicanus through Natural Spawning. COLD SPRING HARBOR Protocols. , (2008).
- Borowsky, R. In Vitro Fertilization of Astyanax mexicanus. COLD SPRING HARBOR Protocols. , (2008).
- Beale, A., et al. Circadian rhythms in Mexican blind cavefish Astyanax mexicanus in the lab and in the field. Nature Communications. 4, 2769 (2013).
- Sato, Y., Sampaio, E. V., Fenerich-Verani, N., Verani, J. R. Reproductive biology and induced breeding of two Characidae species (Osteichthyes, Characiformes) from the São Francisco River basin, Minas Gerais, Brazil. Revista Brasileira Zoology. 23 (1), 267-273 (2006).
- Yasui, G. S., et al. Improvement of gamete quality and its short-term storage: an approach for biotechnology in laboratory fish. Animal. 9 (3), 464-470 (2015).
- Westerfield, M. . The zebrafish book : a guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , (2000).
- Simon, V., Hyacinthe, C., Retaux, S. Breeding behavior in the blind Mexican cavefish and its river-dwelling conspecific. PLoS One. 14 (2), e0212591 (2019).
- Borowsky, R. Determining the Sex of Adult Astyanax mexicanus. COLD SPRING HARBOR Protocols. , (2008).
- Ross, L. G., Ross, B. . Anaesthetic and Sedative Techniques for Aquatic Animals. , (2008).
- Matthews, J. L., et al. Changes to Extender, Cryoprotective Medium, and In Vitro Fertilization Improve Zebrafish Sperm Cryopreservation. Zebrafish. 15 (3), 279-290 (2018).
- Stahl, B. A., et al. Stable transgenesis in Astyanax mexicanus using the Tol2 transposase system. Developmental Dynamics. , 1-9 (2019).
- Elipot, Y., Legendre, L., Pere, S., Sohm, F., Retaux, S. Astyanax transgenesis and husbandry: how cavefish enters the laboratory. Zebrafish. 11, 291-299 (2014).
- Gross, J. B., Borowsky, R., Tabin, C. J. A novel role for Mc1r in the parallel evolution of depigmentation in independent populations of the cavefish Astyanax mexicanus. PLoS Genetics. 5 (1), e1000326 (2009).
- Jeffery, W. R. Chapter 8. Evolution and development in the cavefish Astyanax. Current Topics in Developmental Biology. 86, 191-221 (2009).
- Protas, M., Conrad, M., Gross, J. B., Tabin, C., Borowsky, R. Regressive evolution in the Mexican cave tetra, Astyanax mexicanus. Current Biology. 17 (5), 452-454 (2007).
- Hinaux, H., et al. A developmental staging table for Astyanax mexicanus surface fish and Pachon cavefish. Zebrafish. 8, 155-165 (2011).
- Draper, B. W., Moens, C. B. A high-throughput method for zebrafish sperm cryopreservation and in vitro fertilization. Journal of Visualized Experiment. (29), (2009).
