Collection de gamètes et fertilisation in vitro d'Astyanax mexicanus
Summary
La fécondation in vitro est une technique couramment utilisée avec une variété d’organismes modèles pour maintenir les populations de laboratoire et produire des embryons synchronisés pour des applications en aval. Ici, nous présentons un protocole qui met en œuvre cette technique pour différentes populations du poisson tétra mexicain, Astyanax mexicanus.
Abstract
Astyanax mexicanus est en train d’émerger comme un organisme modèle pour une variété de domaines de recherche en sciences biologiques. Une partie du succès récent de cette espèce de poisson téléostéen est qu’elle possède des populations interfertiles de caverne et de rivière. Cela permet la cartographie génétique des caractères héritables qui ont été fixés lors de l’adaptation aux différents environnements de ces populations. Bien que cette espèce puisse être maintenue et élevée en laboratoire, il est difficile à la fois d’obtenir des embryons pendant la journée et de créer des embryons hybrides entre les souches. La fécondation in vitro (FIV) a été utilisée avec une variété d’organismes modèles différents pour élever avec succès et à plusieurs reprises des animaux en laboratoire. Dans ce protocole, nous montrons comment, en acclimatant A. mexicanus à différents cycles de lumière couplés avec des changements de température de l’eau, nous pouvons déplacer les cycles de reproduction à un moment choisi de la journée. Par la suite, nous montrons comment identifier les poissons parentaux appropriés, recueillir des gamètes sains chez les mâles et les femelles, et produire une progéniture viable à l’aide de la FIV. Cela permet aux procédures connexes telles que l’injection de constructions génétiques ou l’analyse du développement de se produire pendant les heures normales de travail. En outre, cette technique peut être utilisée pour créer des hybrides entre les populations de grottes et de surface, et ainsi permettre l’étude de la base génétique des adaptations phénotypiques à différents environnements.
Introduction
Ces dernières années, Astyanax mexicanus est devenu un organisme modèle dans différents domaines tels que la biologie du développement, la biologie évolutive, la biologie comportementale, et la physiologie1,2,3,4 . L’unicité de ce système vient de cette espèce ayant plusieurs morphotypes qui se sont adaptés à des environnements très différents. Le morphotype d’habitation de surface vit dans les rivières où il y a une grande biodiversité et beaucoup de sources de nourriture pour les poissons. En revanche, les morphotypes des grottes de A. mexicanus, le poisson des cavernes, vivent dans des grottes où la biodiversité, les sources alimentaires et l’oxygène sont considérablement diminués1. Le poisson des cavernes diffère des poissons de surface dans une variété de phénotypes tels que l’absence d’yeux et de pigmentation, la résistance à l’insuline, et la capacité de stocker la graisse2,3,4. Cependant, les poissons de surface et les poissons des cavernes appartiennent toujours à la même espèce et sont donc interfertiles.
Pour les deux morphotypes, un ensemble de conditions a été défini pour permettre l’entretien et la reproduction de routine dans des conditions de laboratoire5,6. Cependant, les modifications génétiques, les études de développement embryonnaires appropriées et la création d’hybrides sont encore difficiles pour plusieurs raisons. A. mexicanus fraye principalement pendant les heures de nuit, ce qui est gênant pour les expériences ultérieures sur les premiers stades embryonnaires tels que l’injection de constructions génétiques ou la surveillance des premiers processus de développement embryonnaire. En outre, la génération d’hybrides de surface et de cavernes est difficile en utilisant le frai naturel, puisque les morphotypes de caverne ont un rythme circadien altéré7 qui affecte finalement la production des ovules viables. Des procédures de FIV réussies, mais invasives, ont été décrites pour d’autres espèces d’Astyanax, où la production de gamètes et le comportement de frai ont été amorcés à l’aide d’injections hormonales8,9. Des procédures de FIV moins invasives (c.-à-d. l’obtention de gamètes à partir de frai manuel sans l’injection de préparations hormonales) ont été décrites, mais ne tiennent pas compte des différences dans le cycle de frai entre les morphotypes de grotte et de surface de A. mexicanus 6.
D’autres organismes modèles de poissons, comme le poisson zèbre, peuvent facilement être génétiquement modifiés et étudiés à un niveau embryonnaire parce que les obstacles mentionnés ci-dessus ont été résolus avec succès. La mise en œuvre de techniques de reproduction normalisées, la fécondation in vitro et la cryoconservation des spermatozoïdes ont tous poussé le poisson zèbre vers l’avant et solidifié l’utilisation du modèle dans les sciences biologiques10. Par conséquent, l’extension de ces techniques à A. mexicanus le renforcera davantage en tant que système modèle.
Ici, nous présentons un protocole détaillé pour la FIV qui aidera à rendre A. mexicanus plus accessible. Nous présenterons une configuration de reproduction qui permet de déplacer les cycles de lumière du poisson de jour en nuit afin que les ovules viables puissent être obtenus pendant les heures de jour sans injection de préparations hormonales. Nous fournissons ensuite une description détaillée de la façon d’obtenir les ovules et les milt utilisés pour la FIV. Cette méthode permettra la production d’embryons pendant les heures normales de travail et rendra d’autres applications en aval plus réalisables que l’utilisation d’embryons issus de frai naturel.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bien que la FIV soit une méthode normalisée pour de nombreux organismes modèles différents tels que le poisson zèbre, les protocoles existants pour A. mexicanus ne tiennent pas compte du fait que cette espèce fraye naturellement pendant les heures de nuit6. Étant donné que les poissons des cavernes et les poissons de surface diffèrent considérablement dans leurs rythmes circadiens, le cycle de maturation des ovules diffère également entre les morphotypes de la grotte et ceux d…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs souhaitent remercier Philippe Noguera et Kimberly Bland pour leur soutien à la production vidéo. Les auteurs aimeraient également remercier toute l’équipe aquatique de l’Institut Stowers pour l’élevage. Ce travail a été soutenu par un financement institutionnel à la DPB et à NR. NR a reçu le soutien de la Fondation Edward Mallinckrodt et de la FRDJ. RP a été soutenu par une subvention de la Deutsche Forschungsgemeinschaft (PE 2807/1-1).
Materials
| 0.6 mL Centrifuge Tube | Eppendorf | #22364111 | |
| 100 mm Petri Dishes | VWR International | #25384-302 | |
| Aspirator Tube | Drummond | #2-000-000 | |
| Calibrated 1-5 µL Capillary Tubes | Drummond | #2-000-001 | |
| Dispolable Spatulas | VWR International | #80081-188 | |
| HMA-50S 50W Aquatic Heaters | Finnex | HMA-50S | |
| P1000 Pipette | Eppendorf | #3123000063 | |
| P1000 Pipette Tips | Thermo Scientific | #2079E | |
| Sanyo MIR-554 incubator | Panasonic Health Care | MIR-554-PA | |
| Sperm Extender E400 | 130 mM KCl, 50 mM NaCl, 2 mM CaCl2 (2H2O), 1 mM MgSO4 (7H2O), 10 mM D (+)-Glucose, 30 mM HEPES Adjust to pH 7.9 with 5M KOH and filter sterilize. Solution can be stored at 4 ˚C for up to 6 months. |
||
| Sponge Animal Holder | Made from scrap foam | ||
| System Water | Deionized water supplemented with Instant Ocean Sea Salt [Blacksburg, VA] to reach a specific conductance of 800 µS/cm. Water quality parameters are maintained within safe limits (Upper limit of total ammonia nitrogen range, 1 mg/L; upper limit of nitrite range, 0.5 mg/L; upper limit of nitrate range, 60 mg/L; temperature, 22 °C; pH, 7.65; dissolved oxygen 100 %) | ||
| Tissue Wipes | Kimberly-Clark Professional | #21905-026 | |
| ZIRC E2 Embryo Media | 15 mM NaCl, 0.5 mM KCl, 1.0 mM MgSO4, 150 µM KH2PO4, 50 µM Na2HPO4, 1.0 mM CaCl2, 0.7 mM NaHCO3. Adjust pH to 7.2 to 7.4 using 2 N hydrochloric acid. Filter sterilize. Stored at room temperature for a maximum of two weeks. |
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