Gamete संग्रह और In Vitro Fertilization के Astyanax mexicanus
Summary
इन विट्रो निषेचन प्रयोगशाला आबादी को बनाए रखने और डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों के लिए सिंक्रनाइज़ भ्रूण का उत्पादन करने के लिए मॉडल जीवों की एक किस्म के साथ एक आमतौर पर इस्तेमाल किया तकनीक है। यहाँ, हम एक प्रोटोकॉल है कि मैक्सिकन टेट्रा मछली, Astyanax मैक्सिकनसके विभिन्न आबादी के लिए इस तकनीक को लागू प्रस्तुत करते हैं.
Abstract
Astyanax mexicanus जैविक विज्ञान में अनुसंधान क्षेत्रों की एक किस्म के लिए एक मॉडल जीव के रूप में उभर रहा है. इस teleost मछली प्रजातियों की हाल ही में सफलता का एक हिस्सा यह है कि यह interfertile गुफा और नदी में रहने वाली आबादी के पास है. यह heritable लक्षण है कि इन आबादी के विभिन्न वातावरण के लिए अनुकूलन के दौरान तय किया गया की आनुवंशिक मानचित्रण सक्षम बनाता है. हालांकि इस प्रजाति को बनाए रखा जा सकता है और प्रयोगशाला में पैदा किया जा सकता है, यह दोनों दिन के दौरान भ्रूण प्राप्त करने और उपभेदों के बीच संकर भ्रूण बनाने के लिए चुनौतीपूर्ण है. इन विट्रो निषेचन (IVF) को विभिन्न मॉडल जीवों की एक किस्म के साथ सफलतापूर्वक और बार-बार प्रयोगशाला में जानवरों की नस्ल के लिए इस्तेमाल किया गया है। इस प्रोटोकॉल में, हम बताते हैं कि कैसे, पानी के तापमान में परिवर्तन के साथ मिलकर विभिन्न प्रकाश चक्र के लिए ए mexicanus acclimateizing द्वारा, हम दिन का एक चुना समय के लिए प्रजनन चक्र बदलाव कर सकते हैं. बाद में, हम दिखाने के लिए कैसे उपयुक्त माता पिता की मछली की पहचान करने के लिए, पुरुषों और महिलाओं से स्वस्थ युग्मकों इकट्ठा, और आईवीएफ का उपयोग कर व्यवहार्य वंश का उत्पादन. यह सामान्य कार्य घंटों के दौरान होने के लिए आनुवंशिक constructs या विकासात्मक विश्लेषण के इंजेक्शन के रूप में संबंधित प्रक्रियाओं को सक्षम करता है। इसके अलावा, इस तकनीक गुफा और सतह में रहने वाली आबादी के बीच संकर बनाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, और इस तरह विभिन्न वातावरण के लिए phenotypic रूपांतरों के आनुवंशिक आधार के अध्ययन को सक्षम.
Introduction
हाल के वर्षों में, Astyanax mexicanus इस तरह के विकास जीव विज्ञान, विकासवादी जीव विज्ञान, व्यवहार जीव विज्ञान, और शरीर क्रिया विज्ञान1,2,3,4 के रूप में विभिन्न क्षेत्रों में एक मॉडल जीव बन गयाहै . इस प्रणाली की विशिष्टता बहुत अलग वातावरण के लिए अनुकूलित किया है कि कई morphotypes होने इस प्रजाति से आता है. सतह ीही फार्मोटाइप उन नदियों में रहता है जहां जैव विविधता अधिक है और मछली के लिए बहुत सारे खाद्य स्रोत हैं। इसके विपरीत, ए मैक्सिकनसकी गुफा रूपरूप, गुफा मछली, गुफाओं में रहते हैं जहां जैव विविधता, खाद्य स्रोत और ऑक्सीजन काफी कमहोजाते हैं 1। गुफाफ़िश विभिन्न प्रकार की फीनोटाइप में सतह की मछली से भिन्न होती है जैसे आँखों और रंजकता, इंसुलिन प्रतिरोध की अनुपस्थिति, और वसा को स्टोर करने की क्षमता2,3,4. हालांकि, सतह मछली और cavefish अभी भी एक ही प्रजाति के हैं और इसलिए, interfertil हैं.
दोनों morphotypes के लिए, शर्तों का एक सेट प्रयोगशाला शर्तों5,6 के तहत नियमित रखरखाव और प्रजनन की अनुमति देने के लिए परिभाषित किया गयाहै. हालांकि, आनुवंशिक संशोधनों, उचित भ्रूण विकास अध्ययन, और संकर के निर्माण अभी भी कई कारणों के लिए चुनौती दे रहे हैं. ए मैक्सिकनस मुख्य रूप से रात के घंटों के दौरान अंडे देता है जो आनुवंशिक निर्माणों के इंजेक्शन या प्रारंभिक भ्रूण विकास प्रक्रियाओं की निगरानी जैसे प्रारंभिक भ्रूण चरणों पर बाद के प्रयोगों के लिए असुविधाजनक होता है। इसके अलावा, सतह और गुफा संकर की पीढ़ी प्राकृतिक अंडे का उपयोग कर चुनौतीपूर्ण है, के बाद से गुफा morphotypes एक बदल circadian ताल7 है कि अंततः व्यवहार्य ova के उत्पादन को प्रभावित करता है. सफल, अभी तक आक्रामक, आईवीएफ प्रक्रियाओं अन्य Astyanax प्रजातियों के लिए वर्णित किया गया है, जहां gamete उत्पादन और अंडे व्यवहार हार्मोनल इंजेक्शन8,9का उपयोग कर primed था. कम इनवेसिव आईवीएफ प्रक्रियाओं (यानी, हार्मोनल तैयारी के इंजेक्शन के बिना मैनुअल अंडे से युग्मक प्राप्त करने) वर्णित किया गया है, लेकिन ए मैक्सिकनस की गुफा और सतह morphotypes के बीच अंडे चक्र में मतभेद पर विचार नहीं है 6.
अन्य मछली मॉडल जीवों, जैसे ज़ेब्राफ़िश, आसानी से आनुवंशिक रूप से संशोधित किया जा सकता है और एक भ्रूण के स्तर पर अध्ययन किया जा सकता है क्योंकि ऊपर उल्लिखित बाधाओं को सफलतापूर्वक हल किया गया है। मानकीकृत प्रजनन तकनीकों के कार्यान्वयन, इन विट्रो निषेचन, और शुक्राणु cryopservation सभी आगे ज़ेब्राफ़िश धक्का दिया है और जैविक विज्ञान में मॉडल के उपयोग को मजबूत10. इसलिए, इन तकनीकों को ए मैक्सिकनस तक विस्तारित करने से इसे एक मॉडल प्रणाली के रूप में और अधिक सुदृढ़ किया जाएगा।
यहाँ, हम आईवीएफ के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल है कि ए मैक्सिकनस और अधिक सुलभ बनाने में मदद मिलेगी मौजूद हैं. हम एक प्रजनन सेटअप पेश करेंगे जो दिन से रात तक मछली के प्रकाश चक्र को स्थानांतरित करने में सक्षम बनाता है ताकि हार्मोनल तैयारियों के इंजेक्शन के बिना दिन के घंटों के दौरान व्यवहार्य ओवा प्राप्त किया जा सके। हम तो कैसे ova और आईवीएफ के लिए इस्तेमाल किया milt प्राप्त करने के लिए की एक विस्तृत विवरण प्रदान करते हैं. इस विधि सामान्य काम के घंटे के दौरान भ्रूण के उत्पादन में सक्षम हो जाएगा और आगे बहाव अनुप्रयोगों और अधिक प्राकृतिक अंडे से भ्रूण का उपयोग करने की तुलना में संभव बनाने के लिए.
Protocol
Representative Results
Discussion
जबकि आईवीएफ ऐसे ज़ेब्राफ़िश के रूप में कई अलग अलग मॉडल जीवों के लिए एक मानकीकृत विधि है, ए मैक्सिकनस के लिए मौजूदा प्रोटोकॉल खाते में नहीं है कि इस प्रजाति स्वाभाविक रूप से रात के घंटे के दौरान अंडे<su…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखकों वीडियो उत्पादन पर उनके समर्थन के लिए फिलिप Noguera और Kimberly Bland शुक्रिया अदा करना चाहूँगा. लेखक भी पशुपालन के लिए Stowers संस्थान की पूरी तैराकी टीम को स्वीकार करना चाहते हैं. इस कार्य को डी पी बी और एनआर को संस्थागत वित्तपोषण द्वारा समर्थित किया गया था। एनआर एडवर्ड Mallinckrodt फाउंडेशन और JDRF द्वारा समर्थित किया गया था. आरपी ड्यूश Forschungsgemeinschaft से एक अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था (पीई 2807/
Materials
| 0.6 mL Centrifuge Tube | Eppendorf | #22364111 | |
| 100 mm Petri Dishes | VWR International | #25384-302 | |
| Aspirator Tube | Drummond | #2-000-000 | |
| Calibrated 1-5 µL Capillary Tubes | Drummond | #2-000-001 | |
| Dispolable Spatulas | VWR International | #80081-188 | |
| HMA-50S 50W Aquatic Heaters | Finnex | HMA-50S | |
| P1000 Pipette | Eppendorf | #3123000063 | |
| P1000 Pipette Tips | Thermo Scientific | #2079E | |
| Sanyo MIR-554 incubator | Panasonic Health Care | MIR-554-PA | |
| Sperm Extender E400 | 130 mM KCl, 50 mM NaCl, 2 mM CaCl2 (2H2O), 1 mM MgSO4 (7H2O), 10 mM D (+)-Glucose, 30 mM HEPES Adjust to pH 7.9 with 5M KOH and filter sterilize. Solution can be stored at 4 ˚C for up to 6 months. |
||
| Sponge Animal Holder | Made from scrap foam | ||
| System Water | Deionized water supplemented with Instant Ocean Sea Salt [Blacksburg, VA] to reach a specific conductance of 800 µS/cm. Water quality parameters are maintained within safe limits (Upper limit of total ammonia nitrogen range, 1 mg/L; upper limit of nitrite range, 0.5 mg/L; upper limit of nitrate range, 60 mg/L; temperature, 22 °C; pH, 7.65; dissolved oxygen 100 %) | ||
| Tissue Wipes | Kimberly-Clark Professional | #21905-026 | |
| ZIRC E2 Embryo Media | 15 mM NaCl, 0.5 mM KCl, 1.0 mM MgSO4, 150 µM KH2PO4, 50 µM Na2HPO4, 1.0 mM CaCl2, 0.7 mM NaHCO3. Adjust pH to 7.2 to 7.4 using 2 N hydrochloric acid. Filter sterilize. Stored at room temperature for a maximum of two weeks. |
Riferimenti
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