Kjønnscelle Collection og in vitro befruktning av Astyanax mexicanus
Summary
In vitro befruktning er en vanlig brukt teknikk med en rekke modell organismer å opprettholde laboratorie bestander og produsere synkroniserte embryo for nedstrøms applikasjoner. Her presenterer vi en protokoll som implementerer denne teknikken for ulike populasjoner av den meksikanske Tetra fisk, Astyanax mexicanus.
Abstract
Astyanax mexicanus fremstår som en modell organisme for en rekke forskningsfelt i biologisk vitenskap. En del av den nylige suksessen til denne tetramerisk fisken arter er at det besitter interfertile hule og elv-bolig populasjoner. Dette gjør det mulig for genetisk kartlegging av arvelige trekk som ble fikset under tilpasningen til de ulike miljøene av disse bestandene. Mens denne arten kan opprettholdes og oppdrettet i laboratoriet, er det utfordrende å både få embryo på dagtid og skape hybrid embryo mellom stammer. In vitro befruktning (IVF) har blitt brukt med en rekke ulike modell organismer å lykkes og gjentatte ganger avle dyr i laboratoriet. I denne protokollen viser vi hvordan, ved acclimatizing A. mexicanus til ulike lys sykluser kombinert med endringer i vanntemperatur, kan vi skifte avl sykluser til en valgt tid på dagen. Deretter viser vi hvordan vi kan identifisere passende foreldre fisk, samle sunne kjønnscellene fra menn og kvinner, og produsere levedyktige avkom ved hjelp av IVF. Dette gjør at relaterte prosedyrer som injeksjon av genetiske konstruksjoner eller utviklingsmessige analyser oppstår under normal arbeidstid. Videre kan denne teknikken brukes til å lage hybrider mellom hulen og overflate-bolig populasjoner, og dermed muliggjøre studiet av genetisk grunnlag av fenotypiske tilpasninger til ulike miljøer.
Introduction
I de senere årene har Astyanax mexicanus blitt en modell organisme i ulike felt som utviklingsmessige biologi, evolusjonær biologi, atferdsdata biologi, og fysiologi1,2,3,4 . Det unike med dette systemet kommer fra denne arten har flere morphotypes som har tilpasset svært ulike miljøer. Overflaten bolig morphotype bor i elver hvor det er høyt biologisk mangfold og rikelig med mat kilder for fisken. I kontrast, hulen morphotypes av A. mexicanus, cavefish, bor i huler hvor biologisk mangfold, mat kilder og oksygen er drastisk redusert1. Cavefish avvike fra overflaten fisk i en rekke fenotyper som fravær av øyne og pigmentering, insulinresistens, og evnen til å lagre fett2,3,4. Imidlertid, overflate fisken og cavefish fremdeles tilhøre det likt art og er, derfor, interfertile.
For begge morphotypes har et sett med betingelser blitt definert for å muliggjøre rutinemessig vedlikehold og avl under laboratorieforhold på5,6. Men genetiske modifikasjoner, riktig embryonale utviklingsstudier, og etablering av hybrider er fortsatt utfordrende av flere grunner. A. mexicanus primært gyte i natt timer som er upraktisk for etterfølgende eksperimenter på tidlig embryonale stadier som injeksjon av genetiske konstruksjoner eller overvåking av tidlig embryonale utviklingsprosesser. I tillegg er generering av overflate og hule hybrider utfordrende å bruke naturlige gyting, siden hulen morphotypes har en endret døgnrytme7 som til slutt påvirker produksjonen av levedyktige OVA. Vellykket, men invasiv, IVF prosedyrer har blitt beskrevet for andre Astyanax arter, der Kjønnscelle produksjon og gyting atferd ble primet bruke hormonelle injeksjoner8,9. Mindre invasive IVF-prosedyrer (dvs. innhenting av kjønnscellene fra manuelle gyting uten injeksjon av hormonelle preparater) har blitt beskrevet, men betrakter ikke forskjellene i gyting syklusen mellom hule og overflate morphotypes av A. mexicanus 6i den.
Andre fisk modell organismer, slik som sebrafisk, kan lett bli genetisk modifisert og studert på en embryonale nivå fordi hindringene nevnt ovenfor er vellykket løst. Implementering av standardiserte avl teknikker, in vitro befruktning, og sperm kryonisk bevaring har alle skjøvet sebrafisk fremover og befestet modellens bruk i biologisk vitenskap10. Derfor, utvide disse teknikkene til A. mexicanus vil ytterligere styrke det som et modell system.
Her presenterer vi en detaljert protokoll for IVF som vil bidra til å gjøre a. mexicanus mer tilgjengelig. Vi vil presentere en avl oppsett som gjør det mulig skiftende lys-sykluser av fisken fra dagtid til natta slik at levedyktig OVA kan fås i løpet av dagen timer uten injeksjon av hormonelle preparater. Deretter gir vi en detaljert beskrivelse av hvordan du skaffer OVA og milt brukes til IVF. Denne metoden vil muliggjøre produksjon av embryo under normal arbeidstid og gjøre ytterligere nedstrøms søknader mer gjennomførbart sammenlignet med å bruke embryo fra naturlig gyting.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mens IVF er en standardisert metode for mange forskjellige modeller organismer som sebrafisk, eksisterende protokoller for a. mexicanus ikke ta hensyn til at denne arten naturlig gyter i løpet av natten timer6. Gitt at cavefish og overflate fisken avviker ganske drastisk i deres døgnrytme, er modnings syklus av egg også forskjellig mellom hule og overflate morphotypes. Mens staging temperaturer og tider for overflate A. mexicanus er godt studert12, cave…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne vil gjerne takke Philippe Noguera og Kimberly bland for deres støtte på video produksjon. Forfatterne ønsker også å anerkjenne hele akvatisk team av Stowers Institutt for husdyrhold. Dette arbeidet ble støttet av institusjonelle midler til DPB og NR. NR ble støttet av Edward Mallinckrodt Foundation og JDRF. RP ble støttet av et stipend fra Deutsche Forschungsgemeinschaft (PE 2807/1-1).
Materials
| 0.6 mL Centrifuge Tube | Eppendorf | #22364111 | |
| 100 mm Petri Dishes | VWR International | #25384-302 | |
| Aspirator Tube | Drummond | #2-000-000 | |
| Calibrated 1-5 µL Capillary Tubes | Drummond | #2-000-001 | |
| Dispolable Spatulas | VWR International | #80081-188 | |
| HMA-50S 50W Aquatic Heaters | Finnex | HMA-50S | |
| P1000 Pipette | Eppendorf | #3123000063 | |
| P1000 Pipette Tips | Thermo Scientific | #2079E | |
| Sanyo MIR-554 incubator | Panasonic Health Care | MIR-554-PA | |
| Sperm Extender E400 | 130 mM KCl, 50 mM NaCl, 2 mM CaCl2 (2H2O), 1 mM MgSO4 (7H2O), 10 mM D (+)-Glucose, 30 mM HEPES Adjust to pH 7.9 with 5M KOH and filter sterilize. Solution can be stored at 4 ˚C for up to 6 months. |
||
| Sponge Animal Holder | Made from scrap foam | ||
| System Water | Deionized water supplemented with Instant Ocean Sea Salt [Blacksburg, VA] to reach a specific conductance of 800 µS/cm. Water quality parameters are maintained within safe limits (Upper limit of total ammonia nitrogen range, 1 mg/L; upper limit of nitrite range, 0.5 mg/L; upper limit of nitrate range, 60 mg/L; temperature, 22 °C; pH, 7.65; dissolved oxygen 100 %) | ||
| Tissue Wipes | Kimberly-Clark Professional | #21905-026 | |
| ZIRC E2 Embryo Media | 15 mM NaCl, 0.5 mM KCl, 1.0 mM MgSO4, 150 µM KH2PO4, 50 µM Na2HPO4, 1.0 mM CaCl2, 0.7 mM NaHCO3. Adjust pH to 7.2 to 7.4 using 2 N hydrochloric acid. Filter sterilize. Stored at room temperature for a maximum of two weeks. |
Riferimenti
- Jeffery, W. R. Regressive evolution in Astyanax cavefish. Annual Review Genetics. 43, 25-47 (2009).
- Gross, J. B., Borowsky, R., Tabin, C. J. A novel role for Mc1r in the parallel evolution of depigmentation in independent populations of the cavefish Astyanax mexicanus. PLoS Genetics. 5, e1000326 (2009).
- Riddle, M. R., et al. Insulin resistance in cavefish as an adaptation to a nutrient-limited environment. Nature. 555, 647-651 (2018).
- Xiong, S., Krishnan, J., Peuß, R., Rohner, N. Early adipogenesis contributes to excess fat accumulation in cave populations of Astyanax mexicanus. Biologia dello sviluppo. 441 (2), 297-304 (2018).
- Borowsky, R. Breeding Astyanax mexicanus through Natural Spawning. COLD SPRING HARBOR Protocols. , (2008).
- Borowsky, R. In Vitro Fertilization of Astyanax mexicanus. COLD SPRING HARBOR Protocols. , (2008).
- Beale, A., et al. Circadian rhythms in Mexican blind cavefish Astyanax mexicanus in the lab and in the field. Nature Communications. 4, 2769 (2013).
- Sato, Y., Sampaio, E. V., Fenerich-Verani, N., Verani, J. R. Reproductive biology and induced breeding of two Characidae species (Osteichthyes, Characiformes) from the São Francisco River basin, Minas Gerais, Brazil. Revista Brasileira Zoology. 23 (1), 267-273 (2006).
- Yasui, G. S., et al. Improvement of gamete quality and its short-term storage: an approach for biotechnology in laboratory fish. Animal. 9 (3), 464-470 (2015).
- Westerfield, M. . The zebrafish book : a guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , (2000).
- Simon, V., Hyacinthe, C., Retaux, S. Breeding behavior in the blind Mexican cavefish and its river-dwelling conspecific. PLoS One. 14 (2), e0212591 (2019).
- Borowsky, R. Determining the Sex of Adult Astyanax mexicanus. COLD SPRING HARBOR Protocols. , (2008).
- Ross, L. G., Ross, B. . Anaesthetic and Sedative Techniques for Aquatic Animals. , (2008).
- Matthews, J. L., et al. Changes to Extender, Cryoprotective Medium, and In Vitro Fertilization Improve Zebrafish Sperm Cryopreservation. Zebrafish. 15 (3), 279-290 (2018).
- Stahl, B. A., et al. Stable transgenesis in Astyanax mexicanus using the Tol2 transposase system. Developmental Dynamics. , 1-9 (2019).
- Elipot, Y., Legendre, L., Pere, S., Sohm, F., Retaux, S. Astyanax transgenesis and husbandry: how cavefish enters the laboratory. Zebrafish. 11, 291-299 (2014).
- Gross, J. B., Borowsky, R., Tabin, C. J. A novel role for Mc1r in the parallel evolution of depigmentation in independent populations of the cavefish Astyanax mexicanus. PLoS Genetics. 5 (1), e1000326 (2009).
- Jeffery, W. R. Chapter 8. Evolution and development in the cavefish Astyanax. Current Topics in Developmental Biology. 86, 191-221 (2009).
- Protas, M., Conrad, M., Gross, J. B., Tabin, C., Borowsky, R. Regressive evolution in the Mexican cave tetra, Astyanax mexicanus. Current Biology. 17 (5), 452-454 (2007).
- Hinaux, H., et al. A developmental staging table for Astyanax mexicanus surface fish and Pachon cavefish. Zebrafish. 8, 155-165 (2011).
- Draper, B. W., Moens, C. B. A high-throughput method for zebrafish sperm cryopreservation and in vitro fertilization. Journal of Visualized Experiment. (29), (2009).
